可吸入性脱氧核糖核酸酶I干粉制剂：一种用于囊性纤维化治疗的稳定便携式替代方案

本研究针对囊性纤维化患者现有雾化吸入重组人脱氧核糖核酸酶I(rhDNase)疗法存在的稳定性差、需冷藏保存、给药耗时等问题，开发了一种基于商业化rhDNase配方(含NaCl和CaCl2·2H2O)的可吸入干粉制剂。采用质量源于设计(QbD)方法，通过23全因子实验设计优化喷雾干燥关键工艺参数，所得干粉制剂展现出适宜肺部递送的体外气溶胶特性(MMAD 3-4μm，FPF 33-41%)，酶活性保留率高达94%，且无细胞毒性，为CF治疗提供了患者友好型替代方案。

在囊性纤维化（CF）这一遗传性疾病的治疗征程中，肺部管理始终是核心战场。患者体内因CFTR基因突变导致黏液清除功能障碍，黏稠的黏液成为细菌滋生的温床，引发反复感染和不可逆的肺损伤。重组人脱氧核糖核酸酶I（rhDNase，商品名Pulmozyme®）作为一款经典的黏液溶解剂，能水解细胞外DNA，有效降低黏液粘度，自1993年获批以来，已成为CF标准治疗的一部分。然而，这份“生命之酶”的递送方式却为其广泛应用设下了障碍：它必须通过耗时漫长的雾化吸入给药，每次治疗需10-15分钟，且设备清洁繁琐；更关键的是，该溶液制剂需要严格的冷链保存（2-8°C），极大地限制了患者的行动自由，导致治疗依从性降低。面对这一挑战，能否将这种液态生物制剂成功转型为一种更稳定、更便携的干粉形式，成为研究人员关注的焦点。

在此背景下，由Aoife B. Cotter等人组成的研究团队在《European Journal of Pharmaceutical Sciences》上发表了他们的最新研究成果。他们独辟蹊径，提出一个大胆的设想：不改变商业化rhDNase雾化溶液（含NaCl和CaCl₂·2H₂O）的现有配方，直接通过喷雾干燥技术将其转化为可吸入干粉制剂（DPI）。为了验证这一概念的可行性，他们选用牛源DNase I（bDNase I）作为rhDNase的模型蛋白，展开了一系列系统性的研究。本研究的核心目的在于：1）采用质量源于设计（QbD）理念，探究喷雾干燥关键工艺参数（CPP）对关键质量属性（CQA）的影响；2）重点评估出口温度（T_out）对粉末特性、体外空气动力学性能、酶活性保留及构象稳定性的影响；3）对最优配方进行体外细胞毒性评估，以确保其肺部给药的安全性。

为达成研究目标，作者团队主要运用了几项关键技术：首先，采用喷雾干燥技术，在特定的质量比例（bDNase I : NaCl : CaCl₂·2H₂O = 1 : 8.77 : 0.15）下制备干粉，并利用实验设计（DoE）优化工艺。其次，通过扫描电子显微镜（SEM）、激光粒度分析仪（Morphologi G3）等对粉末的形貌、粒径分布进行表征。第三，使用新一代撞击器（NGI）评估粉末的体外空气动力学性能。第四，通过DNA-甲基绿显色法测定酶活性，并利用圆二色谱（CD）分析蛋白质二级结构。最后，采用MTT法和LDH释放法，在人呼吸道上皮细胞系（Calu-3细胞）上评价粉末的细胞毒性，并使用一种新型干粉吹入装置进行粉末分散。

3.1.1. 喷雾干燥关键工艺参数（CPP）对干粉关键质量属性（CQA）的影响

通过2³全因子实验设计，研究人员系统评估了进料流速（F_feed）、雾化气流速（F_atom）和出口温度（T_out）的相互作用。研究发现，T_out与F_atom的交互作用对颗粒的几何粒径分布（PSD）具有显著影响。在高F_atom条件下，较高的T_out（如105°C）会导致形成更大、可能更疏松的颗粒，这符合高佩克莱特数（Pe > 1）的成粒规律，即溶剂快速蒸发促使溶质在液滴表面富集。此外，降低F_feed或提高F_atom均有助于减小颗粒粒径。在工艺收率方面，提高F_atom和T_out能显著提升粉末收集率。这些结果为工艺优化提供了明确指导。

3.1.2. 出口温度（T_out）对粉末特性和体外空气动力学性能的影响

固定F_feed和F_atom，重点考察T_out（55, 80, 105°C）的影响。扫描电镜结果显示，T_out显著影响颗粒形态：55°C下获得的颗粒表面褶皱、塌陷；而105°C下获得的颗粒表面更光滑，但出现更多粘连。粒径分析表明，三种温度下粉末的粒径中值（D_(v,50)）均在8-9μm左右，分布较窄，但颗粒形状参数存在差异，55°C下制备的粉末颗粒球形度更高。密度测试显示，55°C下粉末的表观密度显著高于其他两组，暗示其颗粒内部结构更致密。尽管所有粉末的休止角等流动性指标均显示流动性较差，但其体外空气动力学性能却出乎意料地良好：所有粉末的质量中值空气动力学直径（MMAD）在3-4μm之间，发射剂量（ED%）均超过80%，细颗粒分数（FPF%）在33-41%之间，且组间无显著差异，完全满足肺部给药的要求。动态蒸汽吸附（DVS）测试表明，所有粉末均在约80%相对湿度（RH）下发生潮解，这主要归因于配方中的CaCl₂·2H₂O，提示产品需在低湿条件下储存。X射线光电子能谱（XPS）分析揭示了颗粒表面的成分分布不均，bDNase I（通过氮元素含量判断）在表面的富集程度是理论均一分布的5-7倍，而NaCl则更多地分布在颗粒内部，这反映了喷雾干燥过程中不同组分因分子量和表面活性差异导致的迁移规律。

3.1.3. 出口温度（T_out）对酶活性保留和构象稳定性的影响

这是评估蛋白质药物稳定性的核心环节。酶活性测定结果显示，T_out为80°C时，bDNase I的活性保留率最高，达到94% ± 9%；55°C时保留率为71% ± 5%；而105°C时活性急剧下降至29% ± 9%。圆二色谱分析从蛋白质二级结构层面解释了这一现象：与未处理的对照组相比，105°C下喷雾干燥的样品其α-螺旋和β-折叠特征峰几乎消失，表明蛋白质发生了严重的去折叠和构象变化，转变为无规则卷曲结构，这直接导致了酶活性的丧失。而在55°C和80°C下处理的样品，其CD谱图与对照组较为接近，二级结构保持相对完整，尤其是80°C的样品可能发生了有利于酶活的构象重排。这一结果凸显了控制喷雾干燥温度对于保持生物大分子药物活性的极端重要性。

3.1.4. 喷雾干燥粉末的体外细胞毒性评价

研究人员选取了综合表现最优的T_out80°C条件下制备的bDNase I载药粉末及其相应的空白辅料粉末（仅含NaCl和CaCl₂·2H₂O），使用新型干粉吹入装置将其分散到人呼吸道上皮细胞Calu-3上，考察了38 μg/cm²剂量下暴露3小时和24小时的细胞毒性。MTT法检测细胞代谢活性显示，无论是载药粉末还是空白辅料粉末，处理后的细胞存活率均高于70%（国际标准ISO 10993-5规定的无毒界限），且3小时与24小时的结果无显著差异。乳酸脱氢酶（LDH）释放实验进一步证实，细胞膜完整性未受明显影响，LDH释放量极低。这些结果充分表明，该干粉制剂对呼吸道细胞无毒性作用，具有良好的生物相容性，为其后续的肺部应用提供了重要的安全性数据支持。

综上所述，本研究成功验证了将商业化rhDNase雾化溶液直接转化为可吸入干粉制剂的可行性。通过QbD方法优化喷雾干燥工艺，特别是将出口温度控制在80°C左右，能够制备出具有理想肺部沉积特性（MMAD 3-4μm， FPF >30%）、高酶活性保留率（高达94%）且无细胞毒性的干粉产品。这项研究的意义在于：首先，它提供了一种极具潜力的患者友好型CF治疗替代方案，干粉吸入剂具有便携、稳定、给药快捷的优点，有望显著提高患者依从性和生活质量。其次，该方法的核心优势在于“无需改变现有配方”，直接利用已获批的辅料（NaCl和CaCl₂·2H₂O）进行生产，极大地简化了制剂开发流程，降低了监管审批的潜在障碍。最后，该研究为其他生物大分子药物（如肽类、蛋白质、抗体）的肺部干粉递送提供了宝贵的借鉴，展示了在最小化使用或不使用额外稳定剂的情况下，通过精细控制工艺参数来保持蛋白质稳定性的策略。尽管该配方因含盐量高而具有一定的吸湿性，需要适宜的包装和储存条件，但这并不影响其作为一种创新治疗选择的巨大潜力。这项研究为开发下一代CF疗法，乃至推动生物制剂吸入给药领域的发展，迈出了坚实的一步。