含有氧四环素的肥料和矿物肥料会增加生菜种植土壤中抗生素抗性基因的数量

农业实践对土壤及生菜抗生素抗性基因（ARGs）和移动遗传元件（MGEs）的影响研究。通过对比矿物肥料、抗生素污染的有机肥料、铜应用和生物炭处理，发现矿物肥和抗生素有机肥显著增加土壤及植株的ARGs和MGEs丰度，铜处理无显著影响，生物炭则呈现降低趋势，且多因素交互作用显著。

Fernando Ruiz-Torrubia|Carlos Garbisu|Mikel Anza|José Luis Lavín|Lur Epelde

自然资源保护部门，NEIKER – 巴斯克农业研究与发展研究所，巴斯克研究与技术联盟（BRTA），比斯开科技园，P812，48160，Derio，西班牙

摘要

农业实践可能是农业生态系统中抗生素耐药性组的主要驱动因素。基于肥料的肥料的使用、杀菌剂的应用，以及与杀菌剂和/或肥料施用相关的重金属进入农业土壤，都可能影响农业环境中抗生素耐药基因（ARGs）的流行和传播。为了减轻农业中的抗生素耐药性问题，人们提出了替代性土壤改良方法，如生物炭。在这里，我们研究了以下处理方法单独或组合使用对土壤和生菜耐药性组的影响：（i）矿物肥料（NPK）与有机肥料（陈年牛粪，未添加或添加了两剂氧四环素）；（ii）铜的施用；（iii）生物炭的施用。我们评估了这些方法对土壤物理化学性质和微生物特性的影响，包括原核生物群落组成，以及土壤和生菜植物中ARGs和与MGE相关基因的相对丰度。矿物肥料、添加了氧四环素的肥料以及生物炭的施用使土壤中ARGs和与MGE相关基因的丰度增加了2到16倍，同时某些与携带ARG的MGE相关的原核生物家族也有所增加。相比之下，铜的施用降低了土壤微生物活性，但没有影响土壤耐药性组。我们的研究结果强调了评估农业实践对土壤和作物耐药性组影响的重要性，在本研究的条件下，施肥被认为是影响最大的因素。此类评估对于提出管理策略（例如，对基于肥料的改良剂进行预处理）以减轻ARGs向潜在人类病原菌转移至关重要。

引言

抗菌素耐药性危机对人类和公共卫生构成了重大威胁，具有严重的全球性后果（Naghavi等人，2024年）。近几十年来，人们越来越关注环境耐药性组与细菌性人类病原体所表现出的抗生素耐药性（AR）之间的潜在联系（Pal等人，2016年）。某些农业实践已被证明会促进农业土壤和作物中抗生素耐药基因（ARGs）和耐抗生素细菌（ARB）的出现和传播，从而加剧了环境中的抗生素耐药性组（Wang等人，2021年）。

在畜牧业中广泛且往往无节制地使用抗生素（Schar等人，2020年）导致抗生素残留物、ARGs、ARB以及携带ARG的移动遗传元件（MGEs）通过基于肥料的肥料进入土壤和作物（Epelde等人，2018年；Kumar等人，2005年；Wang等人，2021年）。由于抗生素在动物体内经常不能完全代谢，因此施用的剂量中有相当大的一部分（30-90%）以及抗生素转化产物通过尿液和粪便排出，最终进入农业土壤（Kumar等人，2005年；Sarmah等人，2006年）。据报道，在施用肥料后，土壤中AR决定因子的丰度会增加：一项汇总了91项研究结果的最新荟萃分析显示，平均而言，施用受抗生素污染的肥料使农业土壤中ARGs的丰度增加了591%（Zhang等人，2022年）。然而，大多数这些研究的局限性在于它们无法区分观察到的增加是由肥料中的抗生素残留物、ARB还是ARGs引起的（Larsson和Flach，2022年）。在施用肥料后土壤中AR决定因子丰度的增加被归因于：（i）从肥料携带的细菌向土壤细菌转移AR决定因子；（ii）肥料中引入的选择性因子（如抗生素或重金属），这可能有利于土壤中AR决定因子的增殖（Xie等人，2018年）。此外，施肥还与土壤原核生物群落组成和活性的变化有关（Epelde等人，2025年；Francioli等人，2016年；Herzog等人，2015年）。与施用肥料相比，据报道矿物肥料对土壤抗生素耐药性组的影响较小（Cui等人，2024年；Wang等人，2020a；Wu等人，2023年；You等人，2024年），尽管它仍然可以通过pH值依赖的方式影响土壤微生物群落的组成和微生物生物量（Geisseler和Scow，2014年）。

重金属被认为是环境中的AR驱动因素。多项研究观察到，在受重金属污染的农业土壤中，ARB（Berg等人，2005年；Huysman等人，1994年）和AR决定因子（Hu等人，2016年）的比例更高。重金属通过共选择机制在推动AR方面起着关键作用，包括交叉耐药性（一种同时对抗生素和金属具有保护作用的单一耐药机制）、共抗性（同一遗传决定因子内编码的不同耐药机制）、共调节（耐药基因的共享调控）和生物膜形成（Baker-Austin等人，2006年；Huo等人，2024年）。除了施用肥料外，其他农业实践，如使用含重金属的农药或施用有机改良剂，也会导致重金属进入农业土壤（Alvarenga等人，2015年；Fernández-Calviño等人，2010年；Santás-Miguel等人，2020年；Wang等人，2021年；Zhu等人，2013年）。

鉴于此，迫切需要开发和实施有效的修复方法来控制农业生态系统中AR的传播。生物炭是在缺氧环境下生物质热解的产物，已被用于修复受有机和无机污染物（如农药或重金属）污染的土壤（Qiu等人，2022a；Yue等人，2019年）。由于其高孔隙率、大表面积和丰富的功能基团，其应用可以降低土壤中污染物的生物可利用性（Qiu等人，2022a；Yue等人，2019年）。基于生物炭的土壤改良剂还用于提高土壤孔隙率、保水性、pH平衡、碳封存、微生物生物量和作物产量（Premalatha等人，2023年；Tan等人，2017年）。同样，多项研究表明，生物炭的应用可以减少土壤中抗生素、MGEs、ARB和ARGs的丰度（Duan等人，2017年；Li等人，2025年；Ye等人，2016年）。Duan等人（2017年）观察到，生物炭施用后土壤细菌群落组成的变化导致AR决定因子的丰度下降。有人提出，生物炭的应用可以通过（i）吸附抗生素，从而减少暴露细菌的选择压力；以及（ii）改变土壤基质，影响抗生素降解速率并影响细菌群落组成和活性来减少土壤中的AR（Duan等人，2017年；Li等人，2025年）。然而，其有效性高度依赖于生物质来源、热解条件和土壤性质（Ji等人，2022年；Li等人，2025年；Premalatha等人，2023年；Qiu等人，2022a；Tan等人，2017年）。此外，一些温和的修复方法（如生物刺激、生物增强、植物修复、蚯蚓修复）正在被研究作为处理受有机和无机化合物污染土壤的成本效益高、环境友好的解决方案（Lacalle等人，2020年）。

大多数先前的研究单独考察了这些因素（即肥料、重金属、生物炭等）在农业环境中对AR的影响。在现实世界中，这些因素可能同时存在，因此研究它们之间的潜在相互作用至关重要。因此，本研究旨在通过单独和组合研究（i）矿物肥料（NPK）与有机肥料（陈年牛粪，未添加或添加了两剂氧四环素 - OXY）的施肥，（ii）铜的施用，以及（iii）生物炭的施用对土壤和生菜抗生素耐药性组的影响来克服这一局限性。我们假设，与矿物肥料或无抗生素肥料相比，添加了OXY的有机肥料会导致土壤和生菜植物中ARGs和与MGE相关基因的丰度更高，这是由于OXY所施加的选择压力。此外，我们预计这种效应取决于剂量，OXY浓度越高，ARG和与MGE相关基因的丰度越大。关于铜的施用，我们假设它将通过共选择机制增加ARGs和与MGE相关基因的丰度，尽管程度不如OXY暴露。最后，我们假设生物炭的施用会通过改变细菌群落组成，以及在较小程度上通过降低Cu和OXY的生物可利用性来减少ARG和与MGE相关基因的丰度。

部分摘录

土壤特征分析

土壤取自西班牙北部Derio一个草地的表层20厘米处，并立即筛分至<6毫米以进行均匀处理。用于特征分析的一部分土壤在30°C下空气干燥48小时，然后筛分至<2毫米。在实验开始前对土壤进行了特征分析。测定了土壤pH值、可提取钾（K⁺）、奥尔森磷（P）、电导率（EC）、有机物（OM）、总碳（C）、总氮（N）和土壤质地

处理对ARGs和与MGE相关基因相对丰度的影响

在土壤样本中，ANOVA排列分析显示，与未添加OXY或生物炭的样本相比，添加OXY后94%的ARGs的相对丰度显著增加（p<0.05），添加生物炭后90%的ARGs的相对丰度显著增加（补充表3）。OXY和生物炭之间的相互作用对87%的ARGs具有显著性（补充表3）。矿物肥料使89%的ARGs的相对丰度增加，与未添加任何添加剂的样本相比（即

农业实践塑造了土壤和植物耐药性组，对AR风险有影响

我们观察到农业实践可以影响AR决定因子的丰度。然而，与AR相关的公共卫生风险取决于环境耐药性组与人类耐药性组之间的连通性。生态空间之间的连通性是AR传播的主要瓶颈之一，因此，不仅取决于AR决定因子的存在和丰度，还取决于它们在细菌细胞和生态系统中的定位，以及它们与其他因素的关联

结论

我们的研究结果表明，农业实践会增加AR的风险。矿物肥料提高了土壤和植物样本中ARGs和与MGE相关基因的相对丰度，以及与MGE相关基因相关的某些原核生物家族的丰度。在肥料中添加氧四环素在土壤样本中以剂量依赖的方式产生了相同的效果。与普遍认为生物炭可以帮助减轻AR影响的观点相反

CRediT作者贡献声明

Fernando Ruiz-Torrubia：撰写——初稿，研究，正式分析，概念化。Carlos Garbisu：撰写——审稿与编辑，资金获取，概念化。Mikel Anza：撰写——审稿与编辑，研究。José Luis Lavín：撰写——审稿与编辑，正式分析。Lur Epelde：撰写——审稿与编辑，资金获取，概念化。

资金

本工作得到了PRADA PID2019-110055RB-C21项目的资助，该项目由MCIN/AEI/10.13039/501100011033资助。Fernando Ruiz-Torrubia获得了MCIN/AEI/10.13039/501100011033提供的PRE2020–092509博士前奖学金。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Fernando Ruiz-Torrubia报告称获得了西班牙科学与创新部的财政支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。