婷婷·童 | 莉莉·何 | 琳雅·乔 | 雅琴·周 | 结琼·李 | 结亮 | 金娜·傅 | 石根·魏 | 高武·黄 | 向华·夏
中国广西药用植物园，南宁530023
**摘要**
由于植物激素的微量浓度和复杂的植物基质，其在植物样本中的定量分析具有相当大的挑战性。本研究建立并优化了一种简单快速的方法，利用超高效液相色谱与三重四极杆串联质谱（UHPLC-QQQ-MS）技术同时定量多种植物激素，以实现高通量靶向代谢组学分析。该方法具有操作简便和可行性，包括超声辅助提取、离心和氮气流干燥等步骤。样本预处理方法的评估采用了基于相似性到理想解的排序偏好（TOPSIS）化学计量学辅助方法，最终选择含1%甲酸的甲醇作为最佳提取溶剂。定量分析通过多重反应监测方法进行。该方法对31种植物激素进行了验证，用于估计回收率和精度的具体浓度范围为0.25–200 ng/mL，结果显示良好的线性（相关系数：0.9910–0.9999）、灵敏度（LOD：0.01–2.87 ng/g；LOQ：0.02–8.70 ng/g）和准确性（回收率：64.50–129.67%），并且该方法适用于多种药用植物，包括Taxillus chinensis (DC.) Danser、Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl、Citrus grandis “Tomentosa”、Plumeria rubra L. “Acutifolia”和Pogostemon cablin (Blanco) Benth。在实际样品分析中，生长素浓度超过4.07 μg/g，水杨酸浓度范围为0.027–79.7 μg/g，其他类别植物激素的浓度低于1 μg/g。所建立的方法表现出高通量、高准确性和可靠性，可以扩展到其他类型的植物激素和多样的应用场景。该方法为研究多种植物激素在调节药用植物次生代谢物积累中的作用提供了有力工具，有助于阐明复杂的信号转导机制和相互作用网络，并为提高中国药材的质量奠定了基础。
**1. 引言**
植物激素是一类关键的信号分子，用于精确调控植物的生长、发育、分化和代谢过程[1]，[2]，[3]，因此成为植物学研究的重要焦点。次生代谢物对药用植物的有效性至关重要，对其代谢调控的研究已成为热点。植物激素通过调节不同的代谢途径对多种次生代谢物的积累产生深远影响[4]。然而，目前关于次生代谢与植物激素之间相互作用的研究仍然有限，这主要是由于调控过程非常复杂，涉及多种类型的植物激素，因此需要高度灵敏的高通量定量方法。
**用于定量测定植物激素的方法包括光谱技术[5]、色谱方法[6]和基于质谱的方法[7]，[8]。随着先进分析仪器的进步，越来越多的高性能分析平台被逐步应用于这一领域。近年来，有几篇关于使用质谱成像（MSI）技术对生物基质中的植物激素进行空间分析的报告[9]，[10]，[11]。MSI类似于显微切片观察，但仍属于半定量技术。尽管它可以直观显示组织切片中植物激素的空间分布，但其实施受到组织切片精度和基质涂层离子化效率的限制。目前，色谱-串联质谱技术被广泛用于植物激素的定量分析；该技术结合了色谱分离和质谱结构表征，从而能够高效分离目标分析物并获取精确的结构信息。相关文献中记录的主要分析平台包括高分辨率质谱（HRMS）[12]，[13]和三重四极杆质谱（QQQ-MS）[14]，[15]，[16]。HRMS提供有关碎片离子和结构的信息，适用于非靶向分析和差异筛选。然而，用于定量分析植物激素的方法学数据较少。QQQ-MS用于高通量植物激素分析，通过特征离子对和参考化合物丰度比实现准确鉴定/定量。
植物激素通常以微量存在（低于1 μg/g的新鲜组织重量），且不稳定，易受外部因素影响。不同植物激素的性质和浓度差异较大。植物基质中还含有干扰物质。因此，在复杂基质中对微量植物激素进行准确定量分析时，纯化和富集步骤至关重要[17]，[18]。早期研究中主要采用液-液萃取进行纯化；然而，这种方法的杂质去除效率不佳。固相萃取（SPE）[19]是一种广泛用于痕量元素分析的样品预处理技术，包括使用SPE柱[20]、分散SPE（dSPE）[21]，[22]和新兴的功能材料[23]，[24]，[25]等方法。吸附材料选择性地吸附杂质或目标物质以实现纯化，有效提高预处理效率和目标植物激素的回收率。然而，由于吸附剂和溶剂的性质不同，SPE的纯化效率存在显著差异，其适用性仅限于富集结构相似的植物激素，不适合高通量筛选。
化学计量学[26]，[27]，[28]（常称为化学统计学）专注于化学测量的基本理论和方法。它利用统计或数学方法建立化学系统的测量值与该系统状态之间的相关性。靶向代谢组学[29]是指对预定义的一组代谢物进行系统研究和分析，有助于保持代谢组学的完整性和系统性[30]，[31]。将靶向代谢分析与化学计量学方法[32]，[33]相结合，可以建立适当的多元分析方法，为特定代谢物的发现和评估提供更深入的见解[34]，[35]。
**排序偏好到理想解的方法（TOPSIS）[36]，[37】根据评估对象与理想解和反理想解的接近程度对其进行排序。当一个对象最接近理想解且最远离反理想解时，它是最优的；否则是非最优的。这一原理用于多目标决策。**
植物激素主要分为生长素（AUXINs）、细胞分裂素（CKs）、赤霉素（GAs）、脱落酸（ABAs）、茉莉酸（JAs）、水杨酸（SAs）、乙烯（ET）、独脚金内酯（SLs）、油菜素内酯（BRs）以及某些未分类的参与植物生长和代谢过程的调节化合物。在这些类别中，生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、茉莉酸、水杨酸和乙烯已被广泛研究并在植物学研究中得到广泛应用，作为植物生长和代谢途径的关键激素调节因子[26]，[37]，[38]。由于乙烯的化学性质特殊，通常使用气相色谱-质谱（GC-MS）进行分析。因此，本研究建立了一种优化的定量分析方法，利用UHPLC-QQQ-MS/MS同时测定药用植物基质中的31种植物激素，包括ABA、13种生长素、9种细胞分裂素、2种赤霉素、3种茉莉酸和2种水杨酸。所提出的方法具有操作简便和可行性，包括超声辅助提取、离心和氮气流干燥等步骤。采用TOPSIS方法评估所使用的样本预处理方法。该方法在植物组织中有效定量分析31种植物激素方面表现出令人满意的灵敏度、准确性和重复性。
利用这种建立的分析方法，我们确定了来自中国广西省的五种药用植物中的31种植物激素的物种组成和含量水平：Taxillus chinensis (DC.) Danser、Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl、Citrus grandis “Tomentosa”、Plumeria rubra L. “Acutifolia”和Pogostemon cablin (Blanco) Benth。靶向代谢组学被用于分析测定结果。所提出的策略可以增强我们对植物激素生理功能的理解，阐明激素调节药用植物次生代谢的网络机制，并为提高中国药材的质量奠定基础。
**2. 实验**
**2.1. 化学试剂和样品**
共购买了31种植物激素（表A1），同位素内标D4-褪黑素从Tanmo-Quality-Inspection Technology Co.（江苏，中国）购买。乙腈（HPLC）、甲酸（HPLC）和甲醇（HPLC）从Merck（德国达姆施塔特）购买；甲酰胺铵盐（GR）从Xiya Chemical Reagent Co.（山东，中国）购买；乙酸乙酯（GR）和氨（GR）从Guoyao Chemical Reagent Co.（上海，中国）购买。所有溶剂均为保证试剂级。整个研究过程中使用超纯水（Milli-Q系统，Millipore，美国）。
使用锥底刻度离心管（50和15 mL，Corning，美国）和带盖的圆底离心管（10 mL，Lanke，中国）。针状过滤器（聚偏二氟乙烯，PVDF，13 mm × 0.22 μm）和微孔过滤膜（有机和水，50 mm × 0.22 μm）从Jinteng（中国）购买。还使用了混合模式强阴离子交换SPE柱（Styra MAX，60 mg/3 mL，Shimadzu，日本）、混合模式阳离子交换SPE柱（Styra MCX，60 mg/3 mL，Shimadzu，日本）和亲水-疏水平衡柱（Oasis HLB 200 mg/6 mL，Waters，美国）。Taxillus chinensis (DC.) Danser的叶子由金娜·傅教授提供，并作为本研究的模型基质（因为这些叶子相对容易大量获取且具有更复杂的底物背景）；Citrus grandis “Tomentosa”的果皮和果肉由结琼·李和结亮提供；Pogostemon cablin (Blanco) Benth的组织培养苗由英伟教授提供。Plumeria rubra L. “Acutifolia”的叶子和花以及Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl的根茎、叶子和花均来自广西药用植物园。
**2.2. 样品、储备液和溶液的制备**
每种植物激素标准品的储备液以1 mg/mL的甲醇溶液制备，并储存在-20°C的冰箱中，有效期为一个月。随后，通过混合适当体积的每种植物激素标准品储备液并用甲醇稀释至最终体积，制备混合标准储备液。含有相应植物激素浓度的混合标准液储存在-20°C的冰箱中，有效期/稳定性为一个月。
对于每个样品，至少收集三个独立的生物学重复样本，并进行三次技术重复分析以考虑分析变异性。所有样品均在液氮中迅速冷冻，然后储存在-80°C的冰箱中以备后续使用。
样品预处理程序基于先前发表的方法[12]，[13]，[14]，[15]，[16]，[39]进行了修改和优化。样品在液氮中研磨，准确称取2 g研磨后的样品放入50 mL离心管中。加入10 mL含1%甲酸的甲醇溶液，并使用Reax top管振荡器（Heidolph，德国）彻底涡旋混合。随后，在黑暗条件下使用JM-30D-28/45超声波清洗器（Jiemeng，中国）以40 kHz的频率超声处理15分钟，再用Multi Reax管振荡器（Heidolph，德国）剧烈振荡15分钟。样品在4°C和8950 g（10,000 rpm）下使用GL20M台式高速冷冻离心机（Beihong，中国）离心15分钟。收集上清液，并将5 mL上清液转移到Auto EVA30 Plus自动平行浓缩器（Ruike，中国）中。在40°C的水浴中通过氮气流将提取物浓缩至干燥。浓缩后，向残留物中加入0.5 mL甲醇并涡旋混合。混合物通过微孔过滤膜获得最终测试样品溶液。剩余的上清液密封并储存在-20°C，以备将来实验需要时稀释。所提出的方法如图1所示。
**2.3. 仪器**
植物激素的检测使用UHPLC-QQQ-MS（LCMS-8050，配备电喷雾离子源，Shimadzu，日本）进行。Shimpack AQ-C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm，2.7 μm，Shimadzu，日本）在自动进样器中保持在15°C，同时以正离子和负离子扫描模式运行，并采用多重反应监测（MRM），雾化、加热和干燥气流分别为3 L/min、10 L/min和10 L/min。界面温度和溶剂去除温度分别为300°C和526°C。流动相由含有0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵水相和甲醇有机相组成。流速设定为0.4 mL/min，柱温保持在40°C。梯度洗脱程序如下：有机相比例最初保持在20%持续1分钟，然后在3分钟内线性增加到60%，8分钟内增加到85%，10分钟内增加到100%并保持2分钟，之后在12.1分钟时返回到20%并平衡4分钟。
2.4 数据分析
LCMS数据采集使用LCMS LabSolutions（版本5.128 SP1）进行。数据处理，包括标准曲线的线性范围、检测限（LOD）和定量限（LOQ），使用LabSolutions Insight（V40）完成。回收率、精度和基质效应（MEs）使用Microsoft Office Excel 2021计算。数据通过OriginPro 2024、在线统计软件SPSSAU（https://spssau.net/?100000001）和MetaboAnalyst 6.0（https://www.metaboanalyst.ca/）进行统计分析和绘图。图表使用在线绘图软件Biogdp（https://biogdp.com/workspace）制作。
2.5 仪器分析参数的优化
使用每种植物激素的单个标准溶液和混合标准溶液优化了31种植物激素的仪器分析条件。通过正负离子模式扫描选择最佳电离模式，并根据最高灵敏度确定离子对。进一步评估了一系列流动相系统，以纯水、含有0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵水相以及甲醇和乙腈作为有机相。基于MRM质谱中的峰形和分离效率确定了最佳流动相组成。
2.6 样品处理条件的优化
2.6.1 提取溶剂的影响
根据先前文献[12]、[13]、[14]、[15]、[39]、[41]以及每种植物激素的理化性质，选择了最佳提取溶剂的候选材料。共设计了12种不同的溶剂用于提取过程，包括甲醇、含1%甲酸的甲醇、含1%氨的甲醇、含1%甲酸的乙腈、含1%氨的乙腈、乙酸乙酯、含1%甲酸的乙酸乙酯、含1%氨的乙酸乙酯、二氯甲烷、含1%甲酸的二氯甲烷和含1%氨的二氯甲烷。分析采用结合TOPSIS策略[42]、[43]的既定方法进行。进一步使用31种植物激素作为评价指标（m = 31），12种溶剂作为评价对象（n = 12）。通过标准化提取结果构建了无量纲决策矩阵。使用SPSSAU计算每种植物激素的正负理想溶液。计算每种溶剂与最佳/最差溶液（最大/最小值）之间的欧几里得距离，以确定每种溶剂的相对接近程度，并据此进行排序。进行数据标准化以消除维度效应。原始矩阵基于每种溶剂提取的植物激素测定结果构建：X = (xij)n × m。标准化后，矩阵表示为Z = (zij)n × m。标准化使用公式（1）进行，如下所示：
(1)
根据评价指标[44]计算每种植物激素的最佳和次优矩阵向量。最佳向量Z+ = (Z1+, Z2+, ..., Zm+)和次优向量Z- = (Z1-, Z2-, ..., Zm-)使用公式（2）和（3）得出，如下所示：
(2)
(3)
计算每个评价对象与每个指标的正/负理想溶液之间的距离[44]。正理想溶液D+ = (D1+, D2+, ..., Dn+)和负理想溶液D- = (D1-, D2-, ..., Dn-)使用公式（4）和（5）得出，如下所示：
(4)
(5)
计算并排名每种溶剂（评价对象）的综合得分C。较高的综合得分表示评价对象更接近正理想溶液，即更接近最佳水平。综合得分使用公式（6）得出，如下所示：
(6)
2.6.2 氮气流动干燥过程中浓缩温度的影响
评估了通过氮气流动进行溶剂浓缩处理的最佳温度。在两种条件下比较了31种植物激素的回收率：室温（25°C）和水浴加热（40°C）。回收率使用公式（7）计算，如下所示：
(7)
2.6.3 纯化方法的影响
在本研究中，比较了直接浓缩后复溶的高通量方法[46]和典型的SPE方法（三种不同的纯化材料：MAX[47]、MCX[48]和HLB[49]）。比较了31种植物激素在四种纯化方法中的MEs和回收率。MEs计算为每种基质匹配标准溶液的峰面积（A）与纯溶剂标准品的峰面积（A'）的比率[50]。ME使用公式（8）[20]、[51]计算，如下所示：
(8)
值在80%到120%之间表示ME可以忽略不计，大于120%表示信号增强，小于80%表示信号抑制[52]。
2.6.4 稀释可靠性
样品溶液、离心上清液、用甲醇稀释十倍的上清液以及用甲醇稀释一百倍的上清液分别标记为S1、S2、S3和S4。通过向每种溶液中分别加入相应的标准储备溶液，制备了31种植物激素的相同浓度的标准溶液。系统地比较了31种植物激素在不同溶液中的基质效应。
2.7 方法验证
方法验证基于“国际药品技术规范协调委员会（ICH）”、“欧洲药品管理局（EMA）”和“美国食品药品监督管理局（FDA）”的规定[53]、[54]、[55]进行。
在复杂植物组织（如根、茎和叶）中定量植物激素时，需要使用基质匹配的校准曲线来处理潜在的信号干扰，包括抑制或增强效应。在复杂样品的背景下，通过使用相应组织类型（根、茎或叶）的空白或低浓度提取物来构建基质匹配的校准曲线。在本研究中，我们选择了Taxillus chinensis (DC.) Danser的叶子作为方法优化过程中的模型基质。
通过确定LOD和LOQ来评估方法学灵敏度。在我们的研究中，没有使用标准溶液，而是基于分析已知浓度的稀释样品，使用改进的信噪比（S/N）方法来确定LOD和LOQ。该程序首先验证达到正标准品回收率时的正样品浓度，然后逐步稀释标准品，直到峰达到指定的S/N比率。通常，LOD定义为S/N≥3，LOQ定义为S/N≥10，以确保可靠的检测和测量。
通过确定三个控制水平（低、中、高；n = 9）的回收率来评估方法学准确性。31种植物激素的回收率接受标准设定为60–130%。通过确定日内和日间变异性来评估方法学精度。日内精度通过三个控制水平（低、中、高；n = 9）的重复性分析进行评估，日间精度通过连续三天的重复性评估确定。用于估计回收率和精度的具体浓度水平为0.25–200 ng/mL（详细数据见表A2）。相对标准偏差（RSD）的接受标准为一般样品≤15%，低浓度基质匹配标准品≤20%。
3. 结果与讨论
3.1 质谱条件的优化
系统地筛选了流动相的组成，相应结果总结在表1中。随后，优化了色谱梯度，以确保最佳峰形和每个质谱信号的准确识别。31种植物激素的MRM色谱图显示在图2中。每种植物激素的详细离子碎片信息提供在表A3中。
表1. 色谱梯度的优化
| 序号 | 流动相组成 | 相应的峰形 |
| ---- | -------- | -------- |
| 1 | 纯水或含0.1%甲酸的水溶液 | 质谱峰较差且呈拖尾 |
| 2 | 乙腈 | 质谱峰理想，但乙腈成本高且有毒 |
| 3 | 含10 mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸的水相，有机相为甲醇 | 色谱峰呈对称形状 |
图2. 31种植物激素在多反应监测模式下的提取离子色谱图。（柱子：Shimpack AQ-C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm，2.7 μm，Shimadzu，日本）；梯度：有机相比例最初保持在20%持续1分钟，然后在3分钟内线性增加到60%，8分钟内增加到85%，10分钟内增加到100%并保持2分钟，之后在12.1分钟时返回到20%并平衡4分钟；流速：0.4 mL/min；进样体积：2 μL；柱温：40°C。）
3.2 样品处理条件的优化
3.2.1 提取溶剂的影响
不同植物激素的化学性质差异显著。选择提取溶剂对于提取效率至关重要，因为它影响目标植物激素的质子化以及目标植物激素与杂质之间的互溶性[37]、[39]。使用TOPSIS方法评估了12种提取溶剂的提取效率。结果总结在表2中。含1%甲酸的甲醇在提取效率方面排名第一，其次是含1%甲酸的乙腈；此外，含1%氨的二氯甲烷显示出最低的提取效率。这可以归因于这31种植物激素在强极性溶剂中具有更高的提取性，而弱酸性环境可以部分防止其降解[56]。基于这些发现的综合分析，选择含1%甲酸的甲醇作为最佳提取溶剂。
表2. 使用TOPSIS方法获得的溶剂筛选结果
| 评价对象（溶剂） | 正理想溶液D+ | 负理想溶液D- | 综合得分C |
| -------- | -------- | -------- | -------- |
| 1 | 甲醇 | 2.08 | 8.1 |
| 2 | 含1%甲酸的甲醇 | 1.65 | 6.2 |
| 3 | 含1%氨的甲醇 | 2.02 | 1.43 |
| 4 | 乙腈 | 2.00 | 1.35 |
| 5 | 含1%甲酸的乙腈 | 1.93 | 1.62 |
| 6 | 含1%氨的乙腈 | 2.03 | 1.67 |
| 7 | 乙酸乙酯 | 2.10 | 1.30 |
| 8 | 含1%甲酸的乙酸乙酯 | 1.91 | 1.61 |
| 9 | 含1%氨的乙酸乙酯 | 2.50 | 1.18 |
| 10 | 二氯甲烷 | 2.58 | 1.11 |
| 11 | 含1%甲酸的二氯甲烷 | 2.65 | 0.94 |
| 12 | 含1%氨的二氯甲烷 | 2.69 | 0.66 |
| 13 | 含1%氨的二氯甲烷 | 2.69 | 0.66 |
3.2.2 氮气流动干燥过程中浓缩温度的影响
评估了通过氮气流动进行溶剂浓缩处理的最佳温度。在两种条件下比较了31种植物激素的回收率：室温（25°C）和水浴加热（40°C）。回收率使用公式（7）计算，如下所示：
(7)
3.2.3 纯化方法的影响
在本研究中，比较了直接浓缩后复溶的高通量方法和典型的SPE方法（三种不同的纯化材料：MAX[47]、MCX[48]和HLB[49]）。比较了31种植物激素在四种纯化方法中的MEs和回收率。MEs计算为每种基质匹配标准溶液的峰面积（A）与纯溶剂标准品的峰面积（A'）的比率[50]。ME使用公式（8）[20]、[51]计算，如下所示：
(8)
值在80%到120%之间表示ME可以忽略不计，大于120%表示信号增强，小于80%表示信号抑制[52]。
3.2.4 稀释可靠性
样品溶液、离心上清液、用甲醇稀释十倍的上清液以及用甲醇稀释一百倍的上清液分别标记为S1、S2、S3和S4。通过向每种溶液中分别加入相应的标准储备溶液，制备了31种植物激素的相同浓度的标准溶液。系统地比较了31种植物激素在不同溶液中的基质效应。
3.3 方法验证
方法验证基于“国际药品技术规范协调委员会（ICH）”、“欧洲药品管理局（EMA）”和“美国食品药品监督管理局（FDA）”的规定[53]、[54]、[55]进行。
在复杂植物组织（如根、茎和叶）中定量植物激素时，需要使用基质匹配的校准曲线来处理潜在的信号干扰，包括抑制或增强效应。在复杂样品的背景下，通过使用相应组织类型（根、茎或叶）的空白或低浓度提取物来构建基质匹配的校准曲线。在本研究中，我们选择了Taxillus chinensis (DC.) Danser的叶子作为方法优化过程中的模型基质。
通过确定LOD和LOQ来评估方法学灵敏度。在我们的研究中，没有使用标准溶液，而是基于分析已知浓度的稀释样品，使用改进的信噪比（S/N）方法来确定LOD和LOQ。该程序首先验证达到正标准品回收率时的正样品浓度，然后逐步稀释标准品，直到峰达到指定的S/N比率。通常，LOD定义为S/N≥3，LOQ定义为S/N≥10，以确保可靠的检测和测量。
通过确定三个控制水平（低、中、高；n = 9）的回收率来评估方法学准确性。31种植物激素的回收率接受标准设定为60–130%。通过确定日内和日间变异性来评估方法学精度。日内精度通过三个控制水平（低、中、高；n = 9）的重复性分析进行评估，日间精度通过连续三天的重复性评估确定。用于估计回收率和精度的具体浓度水平为0.25–200 ng/mL（详细数据见表A2）。相对标准偏差（RSD）的接受标准为一般样品≤15%，低浓度基质匹配标准品≤20%。
3. 结果与讨论
3.1 质谱条件的优化
系统地筛选了流动相的组成，相应结果总结在表1中。随后，优化了色谱梯度，以确保最佳峰形和每个质谱信号的准确识别。31种植物激素的MRM色谱图显示在图2中。每种植物激素的详细离子碎片信息提供在表A3中。
表1. 色谱梯度的优化
| 序号 | 流动相组成 | 相应的峰形 |
| ---- | -------- | -------- |
| 1 | 纯水或含0.1%甲酸的水溶液 | 质谱峰较差且呈拖尾 |
| 2 | 乙腈 | 质谱峰理想，但乙腈成本高且有毒 |
| 3 | 含10 mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸的水相，有机相为甲醇 | 色谱峰呈对称形状 |
图2. 31种植物激素在多反应监测模式下的提取离子色谱图。（柱子：Shimpack AQ-C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm，2.7 μm，Shimadzu，日本）；梯度：有机相比例最初保持在20%持续1分钟，然后在3分钟内线性增加到60%，8分钟内增加到85%，10分钟内增加到100%并保持2分钟，之后在12.1分钟时返回到20%并平衡4分钟；流速：0.4 mL/min；进样体积：2 μL；柱温：40°C。）
3.2 样品处理条件的优化
3.2.1 提取溶剂的影响
不同植物激素的化学性质差异显著。选择提取溶剂对于提取效率至关重要，因为它影响目标植物激素的质子化以及目标植物激素与杂质之间的互溶性[37]、[39]。使用TOPSIS方法评估了12种提取溶剂的提取效率。结果总结在表2中。含1%甲酸的甲醇在提取效率方面排名第一，其次是含1%甲酸的乙腈；此外，含1%氨的二氯甲烷显示出最低的提取效率。这可以归因于这31种植物激素在强极性溶剂中具有更高的提取性，而弱酸性环境可以部分防止其降解[56]。基于这些发现的综合分析，选择含1%甲酸的甲醇作为最佳提取溶剂。
表2. 使用TOPSIS方法获得的溶剂筛选结果
| 评价对象（溶剂） | 正理想溶液D+ | 负理想溶液D- | 综合得分C |
| -------- | -------- | -------- | -------- |
| 1 | 甲醇 | 2.08 | 8.1 |
| 2 | 含1%甲酸的甲醇 | 1.65 | 6.2 |
| 3 | 含1%氨的甲醇 | 2.02 | 1.43 |
| 4 | 乙腈 | 2.00 | 1.35 |
| 5 | 含1%甲酸的乙腈 | 1.93 | 1.62 |
| 6 | 含1%氨的乙腈 | 2.03 | 1.67 |
| 7 | 乙酸乙酯 | 2.10 | 1.30 |
| 8 | 含1%甲酸的乙酸乙酯 | 1.91 | 1.61 |
| 9 | 含1%氨的乙酸乙酯 | 2.50 | 1.18 |
| 10 | 二氯甲烷 | 2.58 | 1.11 |
| 11 | 含1%甲酸的二氯甲烷 | 2.65 | 0.94 |
| 12 | 含1%氨的二氯甲烷 | 2.69 | 0.66 |
3.2.2 氮气流动干燥过程中浓缩温度的影响
植物激素对温度波动非常敏感，其结构和功能性质容易随温度升高而改变。因此，系统地研究浓缩过程的最佳温度条件对于确保植物激素的稳定性和完整性至关重要。相应结果系统地显示在图3a中。在氮气流动下，40°C时的总植物激素回收率较高。在25°C时，MT、DZ、IAA-Trp、IAA和IBA的回收率低于30%；然而，在40°C的水浴中，回收率超过了50%。这表明在室温（25°C）下延长溶剂蒸发时间可能会导致目标植物激素的显著损失。相反，加速蒸发的适度加热减少了目标植物激素的损失。基于对分析物稳定性和浓缩效率的全面评估，选择40°C的水浴作为氮气吹扫浓缩步骤的最佳加热环境。
图3. 样品处理条件的优化。（a）氮气流动干燥过程中浓缩温度的影响，（b）纯化方法的影响，（c）稀释可靠性。（S1：样品溶液，S2：离心溶液，S3：用甲醇稀释十倍的上清液，S4：用甲醇稀释一百倍的上清液。）
3.3.3 纯化方法的影响
植物激素的含量极少，因此在复杂基质环境中检测它们具有挑战性[57]。因此，经常使用纯化和富集方法来有效去除样品提取物中的杂质并便于其准确测量。四种纯化策略的分析结果系统地显示在图3b中。SPE纯化有效减轻了基质干扰。MAX处理和MCX处理样品中的MEs显著降低，尤其是生长素。然而，SPE纯化步骤并未提高回收率。实际上，一些激素在SPE后的回收率较低（例如，CKs/AUXINs用MAX处理，AUXINs/SAs/JAs用MCX处理）。此外，由于SPE柱的高选择性，样品预处理时间和复杂性增加。根据这些发现，直接浓缩后进行复原被选为后续定量分析的最佳方法。3.3.4. 稀释可靠性分析样品和植物激素的含量差异显著（高达1000倍）[57]。测试溶液在分析前必须进行稀释，稀释可靠性需要验证。图3c显示了31种植物激素的平均测量值（MEs）。由于样品基质中存在植物激素，无法获得合适的空白基质。S1中的TRA以及S1和S2中的TRP和SAG的信号强度达到饱和，这阻止了计算这些植物激素在S1和S2中的MEs。结果证实，由于物理化学性质的差异，S1/S2/S3中的大多数植物激素显示出信号抑制，且ME随着连续稀释而减弱。在S4中，ME可以忽略不计。3.3. 方法验证（线性、动态范围、LOD、LOQ、准确性和精度）[53–55]鉴于植物激素是内源性化合物，获得空白基质是不可行的。含量定量使用标准添加法进行，线性范围和相关系数分别在表A2和表A4中呈现。用于估计回收率和精度的具体浓度水平为0.25–200 ng/mL。所有植物激素在其各自的浓度范围内均表现出优异的线性关系，相关系数范围从0.9910到0.9999。30种植物激素的LOD值一致低于0.1 ng/g，除了JA，其LOD为2.87 ng/g。回收率显示在图4a、图4b和图4c中。31种植物激素的回收率在64.50–129.67%的范围内。详细的回收数据提供在表A5中。方法学精度的结果呈现在图4d和图4e中。所有植物激素的RSD值都在可接受范围内，除了IAA-Trp，其日间RSD为22.15%。下载：下载高分辨率图像（316KB）下载：下载全尺寸图像图4. 准确性和精度的评估。(a) 低水平回收率，(b) 中等水平回收率，(c) 高水平回收率，(d) 日内精度，(e) 日间精度。(QCL：低浓度质量控制；QCM：中等浓度质量控制；QCH：高浓度质量控制)3.4. 样品分析3.4.1. 不同储存时间下Taxillus chinensis (DC.) Danser叶片中31种植物激素的变化Taxillus chinensis (DC.) Danser的叶片被采集、处理并立即储存在超低温冷冻柜中。实验在储存后0个月、1个月、2个月和3个月进行；结果展示在图5中。下载：下载高分辨率图像（449KB）下载：下载全尺寸图像图5. 样品分析。不同储存时间下Taxillus chinensis (DC.) Danser叶片中31种植物激素含量的变化：(a) PCA双坐标图，(b) 聚类热图，(c) 相关性分析图。(a202503：2025年3月采集的样本，储存0个月；a202504：储存1个月；a202505：储存2个月；a202506：储存3个月；A31901-A31903：样本a202503的重复批次；B42801-B42803：样本a202504的重复批次；C52601-A52603：样本a202505的重复批次；D62301-62303：样本a202506的重复批次。) Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl不同器官中31种植物激素含量的变化：(d) PCA双坐标图，(e) 聚类热图，(f) 相关性分析图。(MDG：Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl的根茎；MDH：Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl的花；MDYP：Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl的叶片；mh01-04：样本MDH的重复批次；my01-04：样本MDYP的重复批次；mg01-04：样本MDG的重复批次；(g) 不同样本中植物激素类别含量的变化。(mh：Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl的花；sy：Taxillus chinensis (DC.) Danser的叶片；hr：Citrus grandis “Tomentosa”的果皮；jh：Plumeria rubra L. “Acutifolia”的花；jy：Plumeria rubra L. “Acutifolia”的叶片；mg：Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl的根茎；gm：Pogostemon cablin (Blanco) Benth.的组织培养苗；hp：Citrus grandis “Tomentosa”的果皮；my：Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl的叶片。) 对数据集进行了主成分分析（PCA）（图5a）。储存时间相同的样本聚集在一起，显示出高重复性和可靠性。不同储存时间的组之间有明显的分离，表明植物激素谱存在显著差异。PC1解释了51.6%的方差，一个月储存的样本由于TRP和IAA-Glu的差异而与其他样本区分开来。PC2解释了25.9%的方差，零个月储存的样本由于K、BAPR和CZ的差异而分离。累积起来，PC1和PC2解释了77.5%的方差，表明有效捕获了数据的变异性。进行了聚类分析，结果展示在图5b中。K、BAPR和CZ在零个月储存时含量丰富。TRP、IAA-Glu、IAA-Ala、JA和GA1在储存一个月后浓度升高。MEJA、IP和DZ的水平在储存两个月后增加，而Me-IAA、ICAld和IAA的水平在储存三个月后升高。进行了相关性分析，结果展示在图5c中。目标植物激素根据相关性强度被分为四个簇：簇1（K、BAPR和CZ），簇2（TRP、IAA-Glu、IAA-Ala、JA和GA1），簇3（MEJA、IP和DZ），簇4（Me-IAA、ICAld和IAA）。每个簇的相关系数接近1，表明强正相关。Taxillus chinensis (DC.) Danser叶片在不同储存时间下的植物激素含量的聚类热图和相关性分析与PCA的结果一致。3.4.2. Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl不同器官中31种植物激素含量的变化使用既定方法对Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl的根茎、叶片和花朵中的31种植物激素进行了分析，结果展示在图5中。PCA结果展示在图5d中。同一器官的样本聚集在一起，不同器官有明显的分离。PC1解释了总方差的70.2%，在这个成分上，花朵由于IPR、IAA-Phe、IAA-Ala和IAA-Trp的差异而与其他样本明显区分开来。PC2解释了21.7%的方差，在这个成分上，根茎由于TRA含量的差异而与其他器官更明显地分离。聚类分析结果展示在图5e中。花朵显示出IAA-Gly、IAA-Ala、IAA-Phe、JA、IPR、IAA-Trp、IAA、Me-IAA和TZ的水平升高。叶片的IP、IAA-Glu、SAG、SA含量较高。TRA在根茎中积累。相关性分析结果展示在图5f中。目标植物激素根据相关性强度被分为三个簇：簇1（IAA-Gly、IAA-Ala、IAA-Phe、JA、IPR、IAA-Trp、IAA、Me-IAA、TZ），簇2（SAG、SA），簇3（IP、IAA-Glu）。每个簇的相关系数接近1，表明强正相关。Ophiopogon japonicus (L.f.) 不同器官中31种植物激素含量的聚类热图和相关性分析与PCA的结果一致。3.4.3. 不同样本中植物激素类别含量的变化通过分析包括Taxillus chinensis (DC.) Danser的叶片；Citrus grandis “Tomentosa”的果皮和果肉；Pogostemon cablin (Blanco) Benth.的组织培养苗；Plumeria rubra L. “Acutifolia”的叶片和花朵；以及Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl的根茎、叶片和花朵中的植物激素，进一步验证了既定方法的适用性。结果数据按主要植物激素类别进行了汇总和标准化，如图5g所示。在不同样本中观察到植物激素类型和含量的显著差异。分析显示Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl的花中AUXINs含量最高（约33.9 μg/g），而在Plumeria rubra L. “Acutifolia”的叶片中最低（约4.07 μg/g），同时Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl的花中CK含量最高（约13.3 ng/g），而在Citrus grandis “Tomentosa”的果肉中最低（约1.04 ng/g）。其他植物激素也显示出显著的分布差异。ABA作为一种倍半萜化合物，控制种子和芽的休眠诱导和维持。先前关于ABA组织特异性分布的研究一致表明，其浓度在果实中达到峰值，特别是在成熟阶段[12]。在本研究中，在Citrus grandis “Tomentosa”的果肉中检测到高水平的ABA（约152 ng/g）。SA和JA作为调节次生代谢物和各种植物激素的信号分子，被认为是应激激素。它们触发防御分子的积累，以保护植物免受多种应激因素的侵害[12]，[58]，[59]。在本研究中，在Taxillus chinensis (DC.) Danser的叶片中检测到高水平的SA（约79.7 μg/g），在Plumeria rubra L. “Acutifolia”的花朵中检测到高水平的JA（约57.5 μg/g）。同时，在Plumeria rubra L. “Acutifolia”的叶片中检测到高水平的JA（约333 ng/g）。这种现象被认为是由于样本采集期间发生的低温应激引起的，这可能触发了这些应激响应植物激素在分析样本中的积累。MLT参与调节植物对多种应激类型的响应，包括生物和非生物应激。这些应激因素引起的不良影响通过增强植物抵抗力得到缓解[60]。在本研究中，在Plumeria rubra L. “Acutifolia”的花朵中检测到相对较高的MLT浓度（约0.11 ng/g）。这一观察结果被认为是由于样本采集期间发生的低温应激引起的，这可能触发了分析样本中褪黑素的积累。3.5. 与以往方法的比较本研究建立的方法能够在不使用SPE或衍生处理的情况下高效分离和准确量化植物基质中的31种植物激素。与以往的报告[12]，[13]，[14]相比，该方法能够在单次分析过程中同时检测到更多的植物激素，优于之前的方法。以前的报告记录了在预处理协议中使用SPE柱或dSPE进行样品纯化[14]，[47]，[48]。然而，迄今为止尚未确定通用的纯化材料，这不仅增加了实验成本，还延长了分析时间，并且在洗脱过程中会导致某些植物激素的损失。进一步的先前报告还使用了同位素内标[13]，[14]，[61]并应用内标方法进行精确量化，这需要繁琐的操作和高成本。一些报告需要在特定组分预处理后进行单独分析，从而延长了分析工作流程的时间。相比之下，我们的研究采用了标准添加方法，没有使用内标。优化的MRM方法提高了分析灵敏度，便于假阳性筛选，并更适合绝对定量分析。本研究建立的方法已被验证适用于多类植物激素的常规高通量分析。与其他报道的方法相比，本研究建立的实验程序更快（能够在一周内处理50个样本），更简单（只需要几个预处理步骤），更安全（避免使用高毒性试剂），并且更可靠（具有完整的方法学验证）。尽管以前的研究集中在少量样本的多个组分的定量分析上，但我们的当前方法能够同时确定更多的目标植物激素。后续的方法学发展可以继续扩展并基于实验需求纳入新的目标。这项跨学科研究具有重要意义，并与之前的研究结果一致[62]。尽管该方法表现出优异的整体性能，但MEs仍然不可避免，可能会影响分析过程中的绝对含量计算结果。尝试使用内标方法进行含量计算和基质背景干扰校正，以D4-褪黑素作为内标来量化其他植物激素。这种方法仅校正了少数植物激素，包括MT，而未能校正大多数其他激素。由于植物激素之间的物理化学性质差异较大，单一内标量化是不可行的。获取额外的内标可能会增加实验成本和工作量，从而影响高通量测量的初始目标。此外，由于样本收集范围有限，无法进行更全面的调查；这一方面将在后续实验阶段进一步完善。4. 结论本研究旨在建立一种高通量分析方法，用于同时定量测定多种植物基质中的31种植物激素。与以前的报告相比，我们研究中的样品预处理涉及简单的操作，无需SPE或衍生处理。使用UHPLC-QQQ-MS进行定量分析的方法满足了相关的方法学验证要求。通过这种方法测定了多种来源药用植物中的植物激素含量，并基于化学计量学和靶向代谢组学对结果进行了分析。该方法可以扩展到更多植物激素和应用场景，从而提高分析的全面性。此外，它还可以作为评估植物生长/代谢状态、评价植物激素对药用植物次生代谢物调节作用的生理功能的强大工具，并为中药材的质量研究奠定基础。
**作者贡献声明：**
夏向华：监督、资源提供、项目管理、资金获取、概念构思。
黄高武：方法验证、软件开发、方法学设计。
魏树根：资源提供、数据管理、概念构思。
傅金娥：资源提供、数据管理、概念构思。
梁杰：初稿撰写、方法验证、方法学设计。
李杰琼：初稿撰写、方法验证、方法学设计。
周雅琴：初稿撰写、方法学设计、实验设计。
乔丽雅：初稿撰写、方法学设计、实验设计。
何莉莉：审稿与编辑。
童婷婷：初稿撰写、数据可视化、方法验证、软件应用、方法学设计、实验设计、数据分析、数据管理。
**数据可用性：**
数据可应要求提供。
