引言
猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）是一种有包膜的单股正链RNA病毒，属于α冠状病毒属。PEDV感染可导致猪只，特别是新生仔猪，发生呕吐、严重水样腹泻和脱水，死亡率可高达100%，对全球养猪业构成重大经济威胁。PEDV的刺突（Spike, S）蛋白是主要的表面抗原，含有主要的中和表位，介导病毒与宿主受体的结合及膜融合过程，是疫苗诱导免疫的关键靶标。
在自然选择压力下，PEDV不断发生变异，形成了不同的基因型。根据S基因系统发育分析，PEDV毒株可分为三个主要基因型：经典G1型、流行G2型和重组S-INDEL型。其中，G2型进一步分为G2a、G2b和新兴的G2c亚型。尽管G2型毒株传统上与高毒力相关，但近年来的监测发现，G2c亚型已取代之前的变异株，成为中国猪群中的优势流行毒株，这凸显了对PEDV进化动态进行持续监测的必要性。
疫苗接种是控制PED的主要手段。然而，即使在严格执行疫苗免疫程序的猪场，PEDV疫情仍时有发生。这表明，基于G1a、G1b和G2b亚型的商品化疫苗对当前流行的G2c毒株的交叉保护效力正在下降。因此，猪场越来越多地采用可控的反馈免疫策略，即有意让妊娠母猪暴露于本场的特定病原，以增强经乳传递的母源免疫力。
为应对能够逃避现有免疫力的遗传变异PEDV毒株的出现，本研究对当前流行的G2c亚型毒株进行了全面表征，旨在阐明其抗原性和致病性的变化。通过整合流行病学监测、病毒分离、系统发育分析、结构建模、交叉中和试验和致病性评估，本研究旨在揭示中国当前流行的优势PEDV毒株，阐明新兴G2c变异株S糖蛋白的特征性氨基酸突变，模拟S蛋白的结构变化，比较田间暴露与传统疫苗诱导的交叉中和抗体几何平均滴度（GMT），并评估代表性G2c毒株（AHCZ02）在新生仔猪攻击模型中的毒力。
材料与方法
本研究遵循安徽科技大学生物伦理委员会的批准进行。临床样本（直肠拭子和肠道组织）采集自2021年至2024年中国九个省份出现急性腹泻的猪只。通过逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）对样本进行PEDV检测，并对阳性样本的S基因进行扩增和测序，共获得69条完整的S基因序列。
利用Vero E6细胞从2022年安徽省一次疫情暴发的新生腹泻仔猪样本中成功分离出一株PEDV毒株，命名为AHCZ02。通过间接免疫荧光试验（IFA）和病毒一步生长曲线对分离毒株进行了鉴定和复制动力学分析。此外，对AHCZ02毒株进行了全基因组测序。
使用最大似然法对S基因和全基因组序列构建了系统发育树。通过多序列比对，识别了G1、G2a、G2b、G2c和S-INDEL各亚型的S蛋白共有氨基酸序列及其差异。利用SWISS-MODEL服务器，以Pintung 52毒株（PDB: 7W6M）为模板，对G2a、G2b、G2c、S-INDEL亚型及AHCZ02毒株的S蛋白进行了同源建模，以分析关键突变对蛋白质三维结构的影响。
为评估针对G2c毒株的中和抗体反应，收集了来自六个商品猪场的118份血清样本，并根据反馈暴露和免疫策略分为六组。使用AHCZ02毒株进行了病毒中和试验，测定各组血清的中和抗体几何平均滴度。
为评估AHCZ02毒株的致病性，选取十头3日龄健康长白仔猪，随机分为对照组和攻毒组。攻毒组仔猪经口接种AHCZ02毒株，对照组接种维持培养基。攻毒后，定期监测仔猪的临床状况、粪便评分、存活率和体重变化。实验结束时，对所有仔猪进行剖检，收集肠道组织进行组织病理学检查和免疫组织化学（IHC）分析，以评估病理损伤和病毒抗原分布。
结果
PEDV AHCZ02毒株的分离与鉴定
PEDV AHCZ02毒株分离自2022年安徽省一次腹泻疫情的新生仔猪。该毒株在Vero E6细胞中传代至第9代时，在感染后24小时可诱导明显的合胞体形成等细胞病变效应。IFA结果显示，感染细胞胞浆内存在PEDV核衣壳蛋白的特异性荧光信号。一步生长曲线分析表明，AHCZ02毒株在感染后30小时达到复制峰值，滴度为106.64TCID50/0.1 mL，显示出较强的细胞适应性和复制能力。
2021-2024年中国PEDV的流行病学
对2021年至2024年采集的样本进行分析发现，在获得的69条S基因序列中，G2型毒株占主导地位（92.75%）。其中，G2c亚型占比高达69.57%（48/69），而G2a和G2b亚型分别占20.29%和2.89%，S-INDEL型占7.25%。这一结果确证了G2c亚型是当前中国PEDV流行的绝对优势毒株。
PEDV AHCZ02毒株的基因组特征
对AHCZ02毒株的全基因组测序分析显示，其基因组长度为28,179个核苷酸，具有典型的冠状病毒基因组结构。全基因组系统发育分析进一步确认AHCZ02属于G2c进化分支。同源性比较显示，AHCZ02与G2c参考毒株在主要结构蛋白编码区（如S、M、N基因）具有极高的核苷酸一致性。
PEDV S蛋白的氨基酸特征分析
通过比较各亚型S蛋白的共有氨基酸序列，本研究在G2c亚型（包括AHCZ02）中鉴定出5个区别于G2a/G2b亚型的特征性氨基酸替换：N139D、Y182H、I287M、F345L和L998M。值得注意的是，N139D和I287M替换是G2c亚型特有的，而Y182H、F345L和L998M替换则是G2c与S-INDEL型共有，但与G2a/G2b型不同。
S蛋白结构分析
PEDV的S蛋白包含S1和S2两个亚基，以及信号肽、N末端结构域、融合肽等多个功能域。三维结构同源建模和比较分析表明，上述5个突变中的4个（N139D、I287M、F345L和L998M）会导致S蛋白局部构象发生改变。例如，N139D突变导致其附近区域发生无规卷曲向α-螺旋的转变及β-折叠的缩短；I287M和F345L突变分别引起N末端结构域内β-折叠的缩短和消失；L998M突变则导致S2亚基中α-螺旋的延长。值得注意的是，I287M和L998M两个位点位于S1/S2亚基交界处的三维空间结构中，这些构象变化可能影响抗体的识别与结合。
针对流行性PEDV G2c毒株的中和效力
病毒中和试验结果显示，不同免疫策略诱导的中和抗体水平存在显著差异。采用G2c毒株反馈暴露并结合灭活疫苗加强免疫的猪群，其中和抗体几何平均滴度最高（GMT = 1893）。采用S-INDEL毒株反馈暴露并加强免疫的猪群，GMT为480。而仅使用传统疫苗（基于AJ1102/G2b或CV777/G1a毒株）免疫的猪群，其中和抗体GMT显著较低，分别为40、20和10。未免疫对照组的GMT低于检测下限。
结果表明，G2c反馈暴露组诱导的中和抗体水平是S-INDEL反馈暴露组的3.9倍，证实了不同亚型间存在抗原性差异。更重要的是，所有反馈暴露组（GMT在480-1893之间）诱导的中和抗体水平，是传统疫苗免疫组（GMT在10-40之间）的12倍至189.3倍。这凸显了当前商品化疫苗对占主导地位的G2c变异株的保护效力严重不足。
PEDV AHCZ02毒株的致病性评估
经口接种AHCZ02毒株的3日龄仔猪在感染后24小时内全部出现急性水样腹泻、呕吐等典型临床症状。所有攻毒仔猪在感染后66小时内全部死亡，死亡率达100%。攻毒仔猪体重在感染后48小时内下降超过18%。剖检可见小肠壁变薄、透明、充气，肠腔内积聚黄色液体。组织病理学检查显示，攻毒仔猪的十二指肠、空肠、回肠和结肠均出现严重的绒毛萎缩。免疫组化分析证实，PEDV核衣壳抗原主要分布在空肠和回肠的绒毛上皮细胞内。这些结果综合表明，AHCZ02毒株对新生仔猪具有高度致病性。
讨论
本研究成功分离并全面表征了中国新出现的PEDV G2c亚型代表毒株AHCZ02。流行病学数据证实G2c已成为当前中国的绝对优势流行毒株，与多项独立研究结果一致。AHCZ02毒株在细胞中展现出了高效的复制能力，其病毒滴度达到106.64TCID50/0.1 mL，这可能与其在猪群中的流行优势相关。
研究发现G2c亚型S蛋白存在5个特征性氨基酸突变。其中，N139D突变位于已知的中和表位S10区域内，F345L突变靠近N末端结构域的潜在受体结合界面。三维结构建模揭示，这些突变（特别是N139D, I287M, F345L, L998M）可引起S蛋白关键区域的构象变化，这可能是导致基于旧毒株（如G1a CV777, G2b AJ1102）的疫苗所诱导的抗体对G2c毒株中和能力大幅下降的结构基础。
中和试验数据为这一推断提供了直接证据。传统疫苗免疫猪群的血清对G2c毒株AHCZ02的中和能力极其有限（GMT 10-40），远低于公认的与临床保护相关的阈值（GMT 377-774）。相反，采用同型（G2c）或近似型（S-INDEL）毒株进行反馈暴露免疫的猪群，其中和抗体水平（GMT 480-1893）则显著高于保护阈值。这从免疫学角度解释了为何在严格执行传统疫苗免疫的猪场，PEDV（尤其是G2c毒株）疫情仍会频繁暴发，而反馈免疫策略在实践中往往表现出更好的防控效果。
动物试验进一步证实了AHCZ02毒株的高致病性，感染新生仔猪后导致100%的死亡率及典型的严重肠道病理损伤，其特征与其他报道的高致病性G2c毒株相似。
结论
综上所述，本研究的流行病学调查揭示了G2c亚型是中国当前PEDV流行的绝对优势毒株。成功分离的AHCZ02毒株具有高度的细胞适应性和对新生仔猪的强致病性。其S蛋白上鉴定出的多个特征性突变可能导致蛋白质构象改变，进而影响抗原性。最关键的是，现有的商品化疫苗对当前流行的G2c毒株诱导的中和抗体反应严重不足。这些发现不仅为理解PEDV G2c亚型的分子特征和进化提供了重要见解，更强调了针对当前流行毒株开发匹配疫苗的紧迫性，并为下一代PEDV疫苗的设计提供了关键的抗原靶点信息。持续加强病毒学监测对于有效跟踪和应对PEDV的进化动态至关重要。
