1 引言
动物寄生虫感染深刻影响着宿主健康、种群稳定性、物种互作及生态系统过程。在野生动物研究中，可靠的感染检测至关重要，但传统方法（如显微镜检）面临诸多限制。DNA宏条形码技术为寄生虫鉴定和定量提供了强大的替代方案，其灵敏度和分类分辨率均优于传统方法。然而，不同研究间的样本预处理方法（即DNA提取前的样本制备步骤）差异显著，且其对寄生虫检测的影响尚缺乏充分探讨。本研究旨在响应优化寄生虫宏条形码技术的呼吁，测试了三种粪便样本预处理方法，并评估了其对寄生虫群落检测的影响。
2 材料与方法
2.1 样本采集
研究采集了犹他州韦纳尔附近自由放牧马的粪便样本。样本在采集当晚真空密封以防止寄生虫发育，并在采集后48小时内开始预处理。
2.2 寄生虫卵计数
使用三室麦克马斯特计数板（灵敏度为每克粪便8个虫卵）和双离心粪便漂浮法（灵敏度为每克粪便1个虫卵）测定每个样本的虫卵密度（EPG）。同时，通过烘干法计算了粪便的含水量。
2.3 样本预处理
为比较三种预处理方法，研究将2024年采集的样本均质化后，分别制备了三种类型的子样本：(1) 粪便子样本（无预处理，直接冻存150毫克）；(2) 卵浓缩样本（采用改进的双离心法）；(3) 幼虫样本（通过粪便幼虫培养法收集L3期幼虫）。研究图示清晰地展示了三种方法的流程对比：
2.3.1 通过双离心法进行卵浓缩
该方法改良了常规寄生虫负荷量化的双离心法。将粪便与水滴混合、过滤后离心，弃去上清，将沉淀重悬于蔗糖漂浮液中再次离心，使虫卵浮至液面。使用无菌棉拭子收集表层物质并冻存，以备DNA提取。
2.3.2 幼虫粪便培养
遵循标准方法进行幼虫培养。将粪便与蛭石混合并保湿，在25°C下孵育3周。随后利用幼虫向水性，将其收集到培养皿中，通过离心浓缩，最后用单虫裂解缓冲液（SWL buffer）重悬并冻存。
2.4 DNA提取、文库制备与测序
为比较预处理方法，使用Zymo Quick-DNA粪便/土壤微生物DNA微量提取试剂盒提取了粪便子样本、幼虫和卵拭子的DNA。为比较DNA提取方法，将成对的L3样本分别用上述试剂盒和裂解缓冲液（SWL buffer）法进行提取。所有提取的DNA均送至核心测序设施，使用NC1-NC2引物对ITS2 rDNA区域进行两轮PCR扩增和建库，最终在Illumina MiSeq平台上进行测序。
2.5 生物信息学分析
使用Cutadapt去除引物，DADA2推断序列变体（ASV），并使用phyloseq进行后续过滤。利用Nematode ITS2数据库和DECIPHER包的IdTaxa函数进行物种分类学注释。为便于方法间比较，将最小引导置信度阈值设为50%。对测序数据进行过滤、去除低丰度ASV和抽平等标准化处理。
2.6 统计分析
使用广义线性模型和多元分析方法比较三种预处理方法的结果。分析了虫卵密度与幼虫回收率的关系，检验了不同方法在读数、ASV/物种/属水平丰富度、群落均匀度（Pielou's evenness）以及群落组成（基于Bray-Curtis和Jaccard距离）方面的差异。此外，还比较了裂解缓冲液法与商业试剂盒法在DNA提取效果上的差异。
3 结果
3.1 EPG定量与线虫感染
2024年采集的样本中，双离心漂浮法在所有宿主中均检测到圆线虫卵，而麦克马斯特法仅在12/13的个体中检测到。虫卵密度更高的样本产生了更多的L3期幼虫。
3.2 DNA产量
三种处理方法的DNA产量差异显著。卵拭子和幼虫提取物的产量相似，但均显著低于粪便子样本。对于成对的L3样本，商业试剂盒法与SWL裂解缓冲液法的DNA产量无显著差异。
3.3 预处理方法比较
从13匹马中鉴定出298个ASV，归属于10个属和22种圆线虫。最常见的属包括Cylicocyclus、Cylicostephanus、Cyathostomum等。研究通过K-means聚类将物种和属分为常见类和稀有类，并图示了各方法对不同属和物种的检出率：
幼虫培养法的测序成功率最高。虽然不同方法的测序读数无显著差异，但ASV丰富度受预处理方法和EPG共同影响。幼虫培养法检测到的ASV、物种和属的丰富度均最高，卵浓缩法次之，粪便子样本法最低。具体而言，幼虫、卵浓缩和粪便子样本法平均分别检测到39.15、31.64和15.58个ASV；10.15、7.64和3.67个物种；6.15、5.45和3.08个属。幼虫培养法与卵浓缩法在物种和属水平上的丰富度无显著差异，但两者均显著高于粪便子样本法。粪便子样本中丰富度降低是由于对常见和稀有类群的检测均不足。研究通过回归图和维恩图直观展示了各方法在不同分类水平上的检出差异：
尽管丰富度存在差异，但三种方法的寄生虫群落组成和均匀度相似。主坐标分析图显示，不同方法的样本并未按方法显著分离：PERMANOVA分析也表明，预处理方法对群落组成（无论是基于存在与否还是相对丰度）均无显著影响。对于在至少5个宿主中出现的物种和属，没有发现任一方法对其检测存在显著偏好。
3.4 提取方法比较
对于2025年采集的8个幼虫样本，SWL裂解缓冲液法与商业试剂盒法在ASV、物种和属的丰富度上均无显著差异。两种方法检测到的寄生虫群落组成也无显著差异。虽然差异丰度分析显示，用SWL法提取的样本中，Triodontophorus brevicauda和Cylicocyclus ultrajectinus的读数显著更高，但在属水平上未发现差异。
4 讨论
在测试的方法中，幼虫粪便培养法能最全面地反映寄生虫群落。它测序成功率最高，在各个分类水平上恢复的丰富度最大，且受粪便虫卵密度的影响最小。其优势在于能产生相对清洁、高浓度的幼虫样本，并可使用廉价的裂解缓冲液提取DNA，还能选择性回收活体寄生虫。然而，该方法仅限于能产生自由生活、活动幼虫阶段的寄生虫，且需要大量新鲜粪便、较长的处理时间以及专业的离心和冷冻设备。
卵拭子样本的表现与幼虫培养法相近，在物种和属水平检测到的多样性相似。该方法同样能富集感染阶段，降低宿主和环境DNA污染，且处理速度相对较快，能检测不产生活动阶段的寄生虫。但其仍需新鲜样本和一定的实验室设备，且DNA提取成本较高。
直接从粪便子样本中提取DNA是灵敏度最低的方法。它未能检测到相当一部分常见和稀有类群，尤其是在虫卵计数较低时，会严重低估寄生虫多样性。然而，该方法在样本收集和保存方面具有简便、无需预处理、所需材料量少等优势，并能用于多种其他分析（如微生物组、饮食等）。
5 结论
样本预处理方法显著影响寄生虫（包括常见和稀有类群）的检测。幼虫粪便培养法和新型卵拭子法能最准确地捕捉寄生虫多样性，但均需在样本采集时进行一定处理。直接从粪便子样本中提取DNA便于快速采样和保存，但会漏检相当一部分寄生虫群落。最终，寄生虫宏条形码的最佳预处理方案取决于具体的研究问题和实际条件限制。
