基于外周血mRNA的α/β地中海贫血整合基因分型策略：编码序列与表达水平分析

本综述提出了一种创新性的地中海贫血基因分型策略。研究通过分析外周血来源的mRNA中HBA2、HBA1和HBB基因的全长编码序列及相对表达水平，结合桑格测序（Sanger sequencing）与多重定量荧光PCR（MQF-PCR），旨在实现对编码区突变、大片段缺失及非编码区致病突变的综合检测与预测。该方法覆盖率高、操作简便、成本较低，为提升地中海贫血的临床基因诊断价值提供了新的思路和实验依据。

引言

地中海贫血是一种常见的常染色体隐性遗传病，主要由编码α-珠蛋白或β-珠蛋白链的基因突变引起。基因分型是诊断和预防的关键。传统方法如缺口PCR（Gap-PCR）和反向斑点杂交（PCR-RDB）通常检测基因组DNA，而新一代测序（NGS）等技术虽覆盖广但操作复杂、成本高。本研究旨在探索一种基于外周血mRNA的整合分型策略，通过分析HBA2、HBA1和HBB的编码序列（CDS）及其表达水平，评估其在临床诊断中的应用价值。

材料与方法

本研究纳入了103份来自海口市妇幼保健院（中国海口）的、已通过传统DNA方法预分型的样本，包括21例野生型、49例α-珠蛋白基因突变型和33例HBB突变型。

首先，从外周血细胞中提取总RNA并反转录为cDNA。随后，采用一个整合策略：

1. 1.
   编码序列分析：使用针对HBA2、HBA1和HBB的特异性引物进行PCR扩增，产物纯化后，利用桑格测序分析其全长编码序列，以检测点突变等变异。
2. 2.
   表达水平分析：通过多重定量荧光PCR（MQF-PCR）技术，同时检测HBA2、HBA1和HBB的mRNA相对表达水平。计算两个关键比值：峰值面积比1（PAR1 = PA_HBA2/PA_HBA1）和峰值面积比2（PAR2 = PA_HBB/PA_HBA），用于评估基因表达变化。
   对于cDNA测序未能检出的小缺失（如β^41–42M， HBB: c.126_129del）和小插入（如β^71–72M， HBB: c.216_217insA）突变样本，额外采用了等位基因特异性MQF-PCR（AS-MQF-PCR）进行验证。

结果

编码序列变异分析

桑格测序成功检测到了所有位于编码区的14例替换突变（如HBA2: c.369C>G, HBB: c.52A>T）。然而，对于位于HBB非编码区的13例突变（如β^−28M和β^654M），测序结果为阴性，这与预期一致，因为这些突变不影响成熟mRNA的编码序列。出乎意料的是，10例β^41–42M/β^N和4例β^71–72M/β^N样本的cDNA测序也未检出相应突变，呈现“等位基因丢失”现象。后续通过AS-MQF-PCR成功在这14例样本中特异性检出了突变条带，证实突变转录本存在但丰度极低。T）能被检出，而小缺失突变（c.126_129del）则无法直接观察到。">

利用MQF-PCR预测α-珠蛋白大片段缺失和β-珠蛋白非编码区突变

MQF-PCR分析显示，PAR1和PAR2的数值范围可用于识别常见的α-珠蛋白大片段缺失类型并预测HBB非编码区突变。

• •
  α-珠蛋白大片段缺失：
  • •
    −α^3.7/αα 和 −α^4.2/αα 类型均缺失一个HBA2基因，其PAR1值约为野生型的65%-66%。但−α^3.7/αα的PAR2值显著高于野生型，而−α^4.2/αα的PAR2无显著差异，这有助于区分这两种缺失类型。
  • •
    —^SEA/αα 类型缺失一个HBA2和一个HBA1，其PAR1值约为野生型的117%，PAR2无显著差异。
  • •
    复合杂合缺失 —^SEA/−α^3.7 和 —^SEA/−α^4.2 仅表达HBA1，因此PAR1为0（HBA2不表达），且前者的PAR2显著升高。
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  β-珠蛋白非编码区突变：
  对于HBB非编码区的突变 β^−28M/β^N (c.-78A>G/C) 和 β^654M/β^N (c.316-197C>T)，其PAR2值分别降至野生型的40%和30%，且具有显著统计学差异，而PAR1无显著变化。这表明可以通过PAR2的显著下调来预测这类调控区或剪接位点的突变。

讨论

cDNA桑格测序在检测策略中的特点与优势

与传统DNA测序相比，以cDNA为模板的桑格测序能够直接分析成熟mRNA的编码序列，避免了内含子等非编码区域的干扰。本策略仅需三个反应即可完成HBA2、HBA1和HBB三个基因全长CDS的筛查，对编码区点突变的检测准确率达100%，其检测范围与NGS类似，但操作更直观、成本更低。然而，该方法无法直接检测小缺失/插入突变，需辅以AS-MQF-PCR进行补充验证。

MQF-PCR在检测策略中的特点与优势

通过分析PAR1和PAR2，MQF-PCR能够有效预测α-珠蛋白基因的常见大片段缺失类型和HBB非编码区的致病突变。结果提示，不同缺失类型（如−α^3.7与−α^4.2）对α/β链平衡的影响存在差异，这可能与基因断裂后的拼接模式有关。此外，非编码区突变导致HBB表达水平显著下降，这为理解其致病机制和进行间接基因分型提供了功能层面的依据。

检测策略的局限性

该mRNA策略的主要局限性在于无法直接确定HBB非编码区突变和α-珠蛋白大片段缺失的具体基因型，只能进行预测。对于这些类型的明确分型，Gap-PCR或PCR-RDB等方法更为有效。此外，对于某些小缺失/插入突变，cDNA测序存在灵敏度不足的问题。

结论

本研究提出并验证了一种基于外周血mRNA的α/β地中海贫血整合基因分型策略。该策略结合了cDNA桑格测序对编码区突变的高通量筛查能力和MQF-PCR对表达水平变化的分析能力，具有覆盖较广、操作相对简单、成本较低的优点。尽管存在对非编码区及大片段缺失突变只能进行间接预测的局限，但它为地中海贫血的基因诊断提供了一种值得考虑的补充或替代方案，特别是在资源有限或需要快速筛查编码区未知突变的情境下。该研究也深化了对不同突变类型如何影响珠蛋白基因表达与平衡的理解。