引言
禽传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus, IBV)是冠状病毒科(Coronaviridae)γ-冠状病毒属(Gammacoronavirus)的重要成员，对全球养禽业构成重大经济威胁。其基因组编码的刺突(Spike, S)糖蛋白是病毒致病性、组织嗜性和免疫原性的关键决定因素。其中，S1亚基是宿主中和抗体的主要靶点，也是IBV基因组中遗传变异最高的区域。基于S1基因序列，IBV被分为多个基因群(GI-GVIII)和基因型，如广泛分布的GI-1(包括马萨诸塞型疫苗株)和GI-13(4/91型)，以及区域性流行后扩散的GI-19(QX样)和GI-23(变异2样)等。不同基因型间交叉保护有限，这为疾病控制带来巨大挑战，使得针对特定地区流行基因型的“保护型”疫苗接种策略成为必要。然而，尽管欧洲、亚洲和美洲已开展了广泛的IBV监测，中亚地区，特别是乌兹别克斯坦，其IBV的分子流行病学信息仍属空白。该国拥有该地区规模最大、最密集的家禽产业之一，却缺乏公开的、经同行评议的IBV分子特征数据。本研究旨在填补这一关键知识空白，首次对乌兹别克斯坦的IBV进行分子调查，以阐明当地流行毒株的基因型、进化动力学及潜在抗原特征。
材料与方法
研究于2024年1月至4月在乌兹别克斯坦费尔干纳山谷纳曼干市的八个肉鸡群中进行。根据呼吸窘迫、体重减轻和死亡率增加(9%)等与IB一致的临床症状，共选取32只罗斯308肉鸡。通过无菌采集气管拭子和新鲜死亡鸡的肾脏组织样本，利用滤纸片(FTA®Cards)保存并运送至实验室。
通过等温核酸扩增技术(Circular Amplification Technology, CAT)检测IBV基因组。采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对IBV分离株进行基因分型，引物参照Worthington等方法并稍作修改。扩增产物纯化后使用自动DNA测序仪进行测序。
对获得的S1基因序列，从GenBank下载了代表所有主要IBV基因型(GI-1至GVI-1)的180条全长参考序列，构建全球参考数据集。使用MAFFT算法进行序列比对，并基于最大似然法(Maximum Likelihood, ML)在IQ-TREE中构建系统发育树。使用RDP5软件包筛查潜在重组事件。通过计算非同义(dN)与同义(dS)置换率之比(ω = dN/dS)进行选择压力分析。使用AlphaFold 3服务器预测S1蛋白的三维结构。利用BepiPred-3.0和DiscoTope 3.0服务器分别预测线性与构象性(不连续)B细胞表位。
结果
1. 乌兹别克斯坦IBV毒株的系统发育分类
基于S1基因核苷酸序列的最大似然系统发育分析清晰地将三株乌兹别克斯坦分离株划分为三个不同的单系群，分别对应于已确立的IBV基因型。分离株UZB-IBV-3属于GI-13谱系；UZB-IBV-2明确归属于GI-23基因型；而UZB-IBV-1则与GI-1谱系(包含广泛使用的疫苗株)的参考毒株聚为一类。蛋白质水平的系统发育树显示出相似的拓扑结构，证实了核苷酸和氨基酸分析结果的一致性。在分析的S1基因片段内，UZB-IBV-1与H120参考株(FJ888351)的核苷酸序列一致性为99.06%，UZB-IBV-2与减毒IS/1494/06株(HM131453)为99.06%，UZB-IBV-3与4/91株(KF377577)为95.95%。相应区域的氨基酸序列一致性分别为98.13%、99.07%和92.52%。
2. 位点特异性分析揭示正选择信号与氨基酸异质性
对S1基因的选择压力分析显示，该基因整体上受到强烈的纯化选择(ω < 1)，这与刺突糖蛋白的结构和功能约束一致。然而，这种纯化选择被几个经历强烈正选择(ω > 1)的离散密码子所打断，这些热点可能对免疫逃逸很重要，并且在不同基因型间存在显著差异。
对于GI-1分离株(UZB-IBV-1)，一个高变区显示出高选择压力。具体而言，核苷酸位置1063–1065(密码子355)、799–801(密码子267)和853–855(密码子285)的ω值分别高达1927.0、925.0和841.0。相比之下，这些特定位点在另外两个分离株中并未受到正选择。例如，在GI-23株(UZB-IBV-2)中，氨基酸位点355、267和285处于强纯化选择下(ω值分别为0.06、0.02、56.26)。GI-13分离株(UZB-IBV-3)在这些位点也完全没有显示出正选择(例如，位点355的ω = 0.003)。相反，每个基因型都有其独特的适应性热点，展示了不同的进化路径。例如，GI-23毒株的主要选择热点位于密码子262(ω = 1747.0)和339(ω = 875.0)；GI-13毒株的最强压力位于密码子265(ω = 565.0)和302(ω = 477.0)。
对于GI-1分离株，核苷酸水平的正选择压力直接转化为氨基酸异质性。例如，位点355在高频的谷氨酸(E)和谷氨酰胺(Q)之间变化；位点357存在甘氨酸到天冬氨酸(G > D)的替换。这种高基因型特异性ω峰值与观察到的核苷酸和氨基酸异质性的汇聚表明，虽然S1基因在纯化选择下保持保守的主干，但它被适应性多样化的热点所点缀，这些位点是塑造这些共循环病毒独特结构和抗原谱的关键驱动因素。
3. S1基因中未检测到重组事件
尽管在同一地理区域存在不同基因型的共循环，但使用多种重组检测算法对S1基因的分析均未揭示出具有统计学支持的重组信号。这表明这些IBV毒株的进化轨迹主要由克隆进化主导，即通过从头突变的积累和随后通过选择固定有利等位基因，而非通过水平基因交换。
4. 计算分析预测显著的抗原和结构差异
通过比较计算分析进一步探讨了乌兹别克斯坦分离株之间观察到的遗传差异。利用DiscoTope 3.0服务器从建模的3D结构预测构象性(不连续)B细胞表位，分析表明三株分离株具有不同的抗原谱，预测的表位区域的位置和强度存在显著差异。
随后使用AlphaFold 3服务器生成刺突蛋白的高分辨率三维模型，以空间可视化这些差异。关键的基因型特异性氨基酸替换被映射到这些结构上，包括GI-1分离株中的355E>Q和357G>D替换、GI-23分离株中的254E>R替换以及GI-13分离株中的314S>R替换。这些结构分析揭示了表面拓扑结构的实质性改变，特别是在与差异预测的表位区域直接对应的溶剂暴露环中。预测的抗原变异与切实的结构差异的汇聚，为这些分离株具有抗原差异性提供了有力证据，这一发现对疫苗效力和免疫逃逸具有重要影响。
讨论
本研究首次在乌兹别克斯坦同一生产网络中同时检测到GI-1、GI-13和GI-23这三种基因型不同的IBV毒株。研究农场的疫苗接种程序包括了马萨诸塞(H120, GI-1)和以色列Var2(GI-23)疫苗株，但仍检测到所有三种基因型，这表明当前的疫苗接种计划，尽管包含了抗原性不同的活疫苗，但未能实现对流行田间基因型的完全交叉保护。缺乏GI-13(4/91相关)疫苗成分可能是导致此结果的原因之一。
位点特异性分析表明，乌兹别克斯坦分离株主要受纯化选择，但离散密码子存在强烈的正选择，反映了病毒可能被迫将适应性突变引导至灵活的、溶剂暴露的环中，以逃避免疫监视，同时严格保守蛋白核心以保持感染性。对于GI-1分离株，位点355和357处的替换E355Q和G357D位于刺突头部的表面暴露环中，此类替换已知会改变构象表位，并与可能的免疫驱动逃逸马萨诸塞型疫苗免疫一致。GI-23和GI-13分离株则显示出不同的适应性热点和氨基酸替换，暗示了谱系特异性对不同免疫景观或宿主群体的反应。
未检测到重组事件表明，这些乌兹别克斯坦分离株可能代表了在当地现有疫苗接种方案施加的选择压力下独立进化、以突变驱动的谱系，而非通过近期的基因交换。这种克隆进化模式意味着，该地区出现的新变种更可能通过点突变的逐渐积累而产生，而非通过新重组体的突然形成。
结构建模与B细胞表位预测的结合揭示了乌兹别克斯坦基因型之间显著的抗原差异。GI-1中的E355Q和Q357D、GI-23中的E254R以及GI-13中的R256K、T265I、S283A、D290E和S314R等替换发生在S1顶端的溶剂暴露环上，预计会重塑构象表位的空间构型。这为当前疫苗接种计划下观察到的保护不完全提供了合理的分子解释，因为表面环中的表位漂移即使在全球基因型身份保守的情况下也可能废除中和作用。乌兹别克斯坦分离株的构象表位图与M41(GI-1)毒株的重叠减少，支持了疫苗衍生免疫可能施加亚中和压力、促进这些适应性替换的解释。
从结构上看，AlphaFold衍生的模型表明，这些替换轻微扭曲了S1顶端的曲率和静电势，可能影响受体相互作用以及抗体可及性。这凸显了将结构生物信息学纳入常规IBV监测，以在田间疫苗失效显现之前预测抗原性转变的重要性。
结论
本研究聚焦于乌兹别克斯坦流行IBV的进化与结构动力学。在同一生产网络中同时检测到GI-1、GI-13和GI-23基因型，可能表明是由免疫压力驱动而非重组的平行适应性轨迹。未检测到重组以及S1亚基整体上纯化选择占主导，表明强烈的结构和功能约束限制了基因组重排，强制了蛋白核心的进化保守性。在这些约束下，多样化通过有限点突变的积累进行，这些突变积聚在溶剂暴露环中， subtly重塑构象表位而不改变整体基因型结构。这种表位漂移将抗原表型与遗传谱系解耦，解释了当前疫苗组合提供的保护不完全的原因。总体而言，我们的数据凸显了对中亚地区IBV毒株进化进行研究的需求，这反映了突变与选择之间复杂的相互作用。所鉴定的序列模式与结构区域的进化约束以及局部变异的证据相一致。进一步的分子监测对于更好地描述这些动态并制定更有效的疫苗策略至关重要。
