引言：多步骤细胞操控的挑战与新策略
卵母细胞作为一种基础生物学模型，在基因表达分析、电生理测量和药物筛选中发挥着关键作用。典型的实验流程，如两电极电压钳制（two-electrode voltage clamp, TEVC），需要在不同显微镜工作位点间对卵母细胞进行挑选、微注射、运输、孵育和测量。此过程涉及对多个卵母细胞在不同位点间的反复抓取、运输和放置操作。由于每个卵母细胞具有独特的实验表现，在运输过程中保持其顺序对准确的数据记录至关重要。
传统的玻璃微管结合流体、电或声操控技术，通常一次只能运输一个细胞，效率低下，且多细胞同时吸取会丢失序列信息。近年来，微流控工具作为机器人末端执行器被用于卵母细胞操作，能够有效控制多个细胞的顺序。然而，基于电容传感器的检测方法存在局限，其单点电信号无法提供多细胞的位置信息，可能导致控制误判，且在一次尝试中单细胞放置成功率约为87%，不成功时需要耗时重复操作。
视觉传感由于能提供多目标的精确形态和空间信息，已成为检测和操控宏观及微观物体最有效的方法。然而，传统的显微镜与微流控芯片固定配置策略，在芯片于不同工作位点间移动时，显微镜上的相机无法观察微流道内细胞的位置信息，导致控制失误。
针对以上挑战，本研究提出了一种创新的“双视觉装备微流控芯片”策略，用于辅助多个单卵母细胞的顺序性抓取-运输-放置。
材料与方法：系统集成与视觉控制
本研究构建的系统核心是一个集成了两个微型相机（直径5.5毫米，重量59克）的微流控芯片，该芯片作为机器人操作臂（KWC06020）的末端执行器，构成“芯片上机器人”架构。一个相机（相机1）安装在芯片尖端上方，用于检测卵母细胞抓取/放置的孔位信息；另一个相机（相机2）安装在微流道前部上方，用于持续监测芯片内多个卵母细胞的位置。
微流控芯片采用阱口辅助的鱼骨状结构设计，包含主通道、对称双侧支通道、侧通道、捕获阱口、移液尖端和两个泵连接口。鱼骨状结构使得流体从支通道汇聚到主通道，根据泊肃叶定律（Poiseuille's law）和流体阻力模型，主通道内的流速从前到后逐步增加，形成速度梯度。这种由流体动力聚焦效应产生的流速分布是实现卵母细胞分离的基础，卵母细胞受到的流体动力（阻力Fd ）可表达为 Fh = -Fd = 6πμrV。此外，针对未分离的情况，专门设计的阱口结构可用于捕获单个卵母细胞，以高效处理相邻细胞未完全分开的问题。芯片通过3D打印技术制造，层厚为25微米，并使用耐高温树脂以确保微结构的清晰度和通道通畅性。
实验使用非洲爪蟾卵母细胞，其平均直径约为1.2毫米。为了实现自动化检测，研究采用了基于YOLOv5的深度学习模型进行卵母细胞识别。模型在包含200张图片的数据集上训练了300个周期，平均精度（mAP@0.5）超过0.98，单帧识别时间小于20毫秒，满足实时视觉检测需求。
系统校准涉及两个相机的坐标转换。对于控制机械臂的相机1，通过手眼标定确定相机坐标系{C1}与机械臂坐标系{M}之间的转换关系，以实现目标孔位坐标到机械臂运动坐标的精确映射。对于监测流道内细胞的相机2，则标定其图像像素坐标与微流控芯片物理坐标{F}之间的比例关系，从而将图像中的细胞位置转换为实际物理位置，用于流控反馈。
视觉控制算法分为两部分。相机2的视觉算法用于流控：实时检测流道内至少前两个卵母细胞的位置及其间距。当首个细胞到达释放阈值点时，停止泵1灌注，并根据第二个细胞的位置判断分离状态。若未分离，则启动泵2回抽，将最近的细胞捕获入阱口，实现单细胞隔离。成功分离后，再将队列中的第一个细胞释放到目标孔。相机1的视觉算法用于机械臂控制：结合YOLOv5识别结果，计算目标抓取/放置位置，并驱动“芯片上机器人”自动移动至目标地点。
实验结果：从观察到操控的全流程验证
在视觉观测方面，将相机安装在芯片表面上方35毫米处时，其视野面积可达约1200平方毫米，空间分辨率约为每像素52.5微米，足以清晰成像直径1.2毫米的卵母细胞。
通过COMSOL Multiphysics进行的流场有限元分析表明，鱼骨状结构的主通道中心线流速呈现阶梯式增长，这与支通道流体汇入的理论模型一致。出口尖端区域的流速模拟显示，流速从芯片尖端向孔板底部逐渐降低，有助于实现温和的细胞释放，减少机械冲击。颗粒追踪模拟进一步证实了多个卵母细胞能被成功分离。
在使用水凝胶珠（直径1.2毫米）的验证实验中，相机2成功监测到珠粒在流道内因流体动力聚焦效应而产生的分离过程。随着珠粒向前移动，相邻珠粒间的距离逐渐增大，在首个珠粒到达释放位置时，最大分离距离可达约34毫米（约28倍珠径）。单次尝试的分离成功率约为87%。对于未分离的情况，视觉系统触发阱口捕获机制，整个处理过程耗时小于3.5秒，相比以往依赖重复操作的方法显著提升了效率，且基于图像信息的反馈避免了控制误判。
机械臂运动控制测试显示，在点对点移动中，芯片尖端的位置控制精度小于0.15毫米，远小于卵母细胞直径，满足精准定位要求。
在最终的卵母细胞实验验证中，系统成功展示了多种复杂操作能力。首先，在同一孔板内实现了卵母细胞的图案化（排布成“H”形）和重排（修改为“n”形）。其次，系统能够从混合孔板中识别并特异性抓取目标（经蓝色处理的）卵母细胞。分析表明，当吸取流速超过10毫升/分钟时，卵母细胞能被可靠抓取。最终，系统演示了多卵母细胞在不同孔板工作位点间的顺序性抓取-运输-放置全过程。卵母细胞从源孔板被顺序吸取后，封装在流道内的“芯片上机器人”将其运输超过30毫米的距离至目标孔板，再逐个顺序放置。整个过程中，卵母细胞在运输阶段保持静止，未观察到明显形变或损伤。操作总时间包括机械臂移动时间和单细胞抓取/放置时间，证明了系统在跨空间、保序性细胞操控方面的可靠性。
讨论与结论
本研究提出的双视觉微流控芯片系统，通过将视觉传感直接集成于移动的微流控末端执行器上，实现了对卵母细胞在多工作位点间连续的、时空序列化的操控。与传统的点式电容传感相比，视觉反馈提供了全面的时空信息，能有效处理未分离的异常情况，保证系统连续运行。与固定平台的显微镜系统相比，它打破了视野限制，实现了宏-微尺度的操作衔接。
鱼骨状流道与阱口结构结合视觉流控，被证明能高效实现顺序性细胞分离及异常处理。流场模拟与实验观测均证实了流速梯度分布对细胞分离的促进作用。阱口设计增强了操作的鲁棒性。这一视觉-机械配置在微流控卵母细胞操控中鲜有报道，标志着向智能化微操作平台迈进的重要一步。
当然，系统仍有改进空间。嵌入式相机的分辨率对于更小的细胞类型或亚细胞结构可能不足。相机帧率限制了检测速度，更小尺寸的细胞在现有流道中可能面临重叠难题。未来的工作可聚焦于集成更高分辨率的微光学传感器、结合立体视觉深度感知，以及开发基于视觉反馈的自适应流控算法。
总之，本研究证明，集成双视觉的微流控芯片与机器人操作臂相结合，能够实现卵母细胞的顺序性操控。该系统仅通过视觉引导的微流控芯片内的流体动力聚焦效应，即可有效分离并顺序释放多个卵母细胞。阱口结构的设计可选择性捕获单个细胞，有效解决微通道中相邻细胞未完全分离的问题。另一相机指导的机械臂实现了单细胞的自动抓取与放置。利用双视觉配置，“芯片上机器人”系统成功完成了跨不同孔板工作位点的多卵母细胞自动化抓取、运输和放置。该方法为灵活、自动化的单细胞工程学应用提供了优势平台。
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