文章内容
在应对日益严峻的全球公共卫生威胁——产碳青霉烯酶革兰氏阴性菌，特别是表达金属β-内酰胺酶(MBL)的肠杆菌目细菌感染时，临床治疗选择极为有限。美国传染病学会(IDSA)推荐将氨曲南(ATM)联合头孢他啶-阿维巴坦(CZA)作为这类感染的一线经验性治疗方案。其作用机制在于，阿维巴坦能够“屏蔽”氨曲南，使其免受Ambler A类和D类丝氨酸碳青霉烯酶以及C类超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的水解，而氨曲南本身不易被B类MBLs水解，从而发挥抗菌活性。该联合用药方案对嗜麦芽窄食单胞菌(S. maltophilia)也有效，但文献报道对产MBL的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)和不动杆菌属(Acinetobacterspp.)的疗效有限。
准确、快速地检测病原菌对ATM/CZA联合用药的敏感性，对于避免因延迟使用有效抗生素而导致的患者伤害至关重要。临床和实验室标准协会(CLSI)推出的肉汤纸片洗脱法(BDE)是检测该组合药敏的认可方法，但其操作繁琐、所需工作量及材料较多，难以在高通量的临床微生物实验室中实施。因此，本研究旨在评估两种更简便的基于琼脂的检测方法——E-试验/纸片扩散法(E-DD)和双纸片扩散法(DDD)，并以BDE法作为参考方法进行比较验证。
研究方法与设计
本研究共纳入94株临床分离菌株，包括35株肠杆菌目、19株嗜麦芽窄食单胞菌、23株铜绿假单胞菌和17株不动杆菌属细菌。所有菌株此前均对氨曲南和头孢他啶-阿维巴坦单药耐药。研究严格按照CLSI M52 Ed. 1标准进行，以BDE法为参考方法，平行进行E-DD法和DDD法药敏试验。
BDE法的操作遵循CLSI M100 Ed. 34指南，通过肉眼观察添加ATM、CZA及两者联合纸片的肉汤管在孵育后是否出现浑浊来判断细菌生长，从而判定“敏感”或“耐药”。
E-DD法的操作如Rawson等人所述。在接种了菌液的Mueller-Hinton琼脂平板上，将CZA的E-试验条和ATM纸片中心距15mm放置，使ATM纸片与肠杆菌目和铜绿假单胞菌的ATM最低抑菌浓度(MIC)折点(8 μg/mL)对齐。孵育后，通过两种方式判断结果：一是肉眼观察E-试验条与ATM纸片之间是否存在清晰的抑菌圈（无论大小或形状）；二是测量抑菌圈半径并计算直径，再根据CLSI M100的ATM折点（肠杆菌目和铜绿假单胞菌的标准，不动杆菌属和嗜麦芽窄食单胞菌也参考此标准）进行判读。
DDD法的操作则依据Falcone和Verschelden等人的描述。在琼脂平板上放置中心距20mm的ATM和CZA纸片，孵育后的结果判读方式与E-DD法相同。
研究结果
首先，BDE法的结果显示，在ATM/CZA联合作用下，35株肠杆菌目中有26株(74%)、19株嗜麦芽窄食单胞菌中有15株(79%)恢复了氨曲南敏感性。而所有铜绿假单胞菌和不动杆菌属菌株对联合用药均表现为耐药。
在方法学验证方面，两种琼脂法均表现良好。与参考方法BDE相比：
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E-DD法：当仅通过肉眼观察抑菌圈（定性判读）时，与BDE的分类一致性(CA)为96%，但存在8%的重大误差(VMD)。当通过测量抑菌圈直径并应用CLSI折点（定量判读）时，CA为93%，仅有7%的微小误差(MinD)，无重大误差或主要误差(MD)。
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DDD法：定性判读时，CA为93%，VMD为13%。定量判读时，CA提高至96%，MinD为4%，无VMD或MD。
值得注意的是，导致定性判读出现VMD的菌株（E-DD法4株，DDD法7株）都只产生了非常小的抑菌圈，通过定量测量并根据CLSI折点判读，这些结果被正确地归类为“中介”或“耐药”，从而消除了VMD。这表明，引入客观的测量步骤对于减少判读的主观性和确保结果准确性至关重要。
按菌种群组分析，两种琼脂法对肠杆菌目细菌的验证结果均满足CLSI M52的验证阈值标准。对于铜绿假单胞菌和不动杆菌属，CA、VMD和MinD率均在可接受范围内，但由于BDE法未检出敏感株，故无法计算MD率。嗜麦芽窄食单胞菌组的CA率（E-DD 79%， DDD 89%）相对较低，MinD率（E-DD 21%， DDD 11%）略高，但鉴于样本量小，此结果需谨慎解读。
此外，精密度测试显示，BDE、DDD和E-DD三种方法在三次独立运行中对五种质控菌株的精密度分类一致性(PCA)均为100%。
讨论与结论
本研究成功验证了两种基于琼脂的药敏检测方法——E-DD和DDD，用于评估ATM/CZA联合用药的敏感性。结果显示，定量判读（测量抑菌圈直径并应用CLSI折点）的性能优于定性判读（仅肉眼观察），能够使两种方法均满足CLSI M52的验证标准。定量方法消除了主观性，确保了结果解读的客观性，有利于新用户的培训和结果的准确比较。
本研究也提供了本地菌株对ATM/CZA敏感性的基线数据。数据显示，产MBL肠杆菌目菌株的联合用药敏感性(74%)略低于文献报道的85-99%。嗜麦芽窄食单胞菌的敏感性(79%)也低于此前>90%的估计。研究中所有铜绿假单胞菌和不动杆菌属菌株均对联合用药耐药，这与部分先前研究的结果存在差异。
本研究存在一定局限性。首先，参考方法为CLSI BDE法而非金标准肉汤微量稀释法(BMD)，但鉴于BDE法在初始验证中与BMD法结果高度一致，此选择被认为是可行且务实的。其次，各菌种群组的样本量有限，影响了亚组分析结果的精确性。最后，研究未评估来自不同生产商的Mueller-Hinton肉汤、琼脂和抗生素纸片，不同厂商的原料差异可能影响结果，这是其他实验室在实施类似方法时需要考虑的因素。
总之，E-DD和DDD是评估头孢他啶-阿维巴坦与氨曲南联合用药敏感性的有效方法，与BDE法相比表现良好。通过采用标准化的解读策略（即应用CLSI抑菌圈测量折点），最大限度地减少了此前该类检测方法中存在的主要限制——解读不一致性。在美国，氨曲南-阿维巴坦复方制剂已获FDA批准，但加拿大尚未上市，且CLSI尚未发布其专用折点。在此过渡期间，E-DD和DDD法可用于指导多重耐药革兰氏阴性菌感染患者合理使用氨曲南联合头孢他啶-阿维巴坦方案，为临床治疗决策提供关键实验室依据。
