负载姜黄素和银纳米颗粒的聚合物-脂质杂化脂质体：一种用于皮肤癌光动力治疗的策略

姜黄素与银纳米颗粒协同负载于聚脂脂质混合脂体中，显著提升光动力治疗效果。实验表明该复合脂体粒径小（<130 nm）、包封率高（>99%），且通过金属增强效应（ME1O2）使单线态氧量子产率显著提高，体外和体内实验均证实其能有效抑制B16-F10黑色素瘤生长并延长生存期。

雅拉·舒文斯基·里肯（Yara Schuvinski Ricken）、埃洛亚·拉托切斯基（Eloah Latocheski）、赫洛伊莎·迪尔·多林（Heloisa Diehl Doring）、道格拉斯·波尔图（Douglas Porto）、乔纳森·保罗·阿格尼斯（Jonathan Paulo Agnes）、芭芭拉·多斯桑托斯（Barbara dos Santos）、丹尼尔·拉扎罗·加林多·博尔赫斯（Daniel Lázaro Gallindo Borges）、蒂亚戈·卡昂（Thiago Caon）、阿尔费乌·扎诺托-菲略（Alfeu Zanotto-Filho）、卡米拉·法比亚诺·弗雷塔斯（Camila Fabiano Freitas）

巴西圣卡塔琳娜联邦大学（Federal University of Santa Catarina，简称UFSC）化学系，弗洛里亚诺波利斯（Florianópolis），圣卡塔琳娜州（SC）

摘要

近年来，皮肤癌的发病率持续上升。基于植物的疗法历史悠久且应用广泛，但单独提取的活性化合物的治疗效果往往有限。姜黄素（Curcumin，简称CUR）是一种具有抗癌特性的天然多酚，其生物利用度较低，这一问题通过使用聚合物纳米颗粒和脂质体等定制的配方和递送系统得到了改善。姜黄素在光动力疗法（Photodynamic Therapy，简称PDT）中还可用作有效的光敏剂（Photosensitizer，简称PS），在光照激活下能产生单线态氧（¹O₂）等细胞毒性物质。姜黄素与银纳米颗粒（Silver Nanoparticles，简称AgNPs）的结合具有巨大潜力，因为金属可以增强单线态氧的生成（Metal-enhanced singlet oxygen generation，简称ME¹O₂）。本研究将姜黄素和银纳米颗粒结合到由DPPC和三嵌段共聚物F127组成的聚合物-脂质混合脂质体中。所得到的DPPC-F127-AgNPs-CUR脂质体直径小于130纳米，多分散性低（Đ <0.20），ζ电位在±10 mV之间，包封效率高达99%以上。光谱分析证实姜黄素已成功包裹在脂质体内。光物理分析显示，姜黄素的荧光量子产率降低，有利于PDT效果，同时单线态氧的生成量增加，ME¹O₂效应显著。体外渗透实验表明，通过脂质体递送姜黄素后，其在皮肤层中的滞留时间延长。在B16-F10黑色素瘤细胞中的实验表明，含有姜黄素的制剂具有细胞毒性，尤其是在经过PDT处理后。体内实验显示，对于携带皮下B16-F10黑色素瘤的小鼠，DPPC-F127-AgNPs-CUR联合PDT使用后，肿瘤生长受到抑制，生存期延长。

引言

皮肤癌，包括非黑色素瘤和黑色素瘤类型，是全球最常见的恶性肿瘤之一。2022年报告的新病例超过150万例，预计到2040年这一数字可能超过230万例。[1] 临床上，这些癌症主要分为两类：非黑色素瘤皮肤癌（Non-melanoma Skin Cancers，简称NMSCs），起源于表皮细胞；黑色素瘤皮肤癌（Melanoma Skin Cancers，简称MSCs），起源于黑色素细胞。两者合计占所有报告病例的近95%，而其他皮肤肿瘤相对较少见。皮肤癌的高发病率和复发特性凸显了其公共卫生重要性。长期暴露于紫外线是主要的风险因素，尽管遗传倾向也会增加患病风险。[2]

NMSCs是最常见的皮肤癌类型，主要包括基底细胞癌（Basal Cell Carcinoma，简称BCC，起源于基底细胞）和鳞状细胞癌（Squamous Cell Carcinoma，简称SCC，起源于鳞状细胞）。[3] 尽管BCC很少致命，但如果不及时治疗，可能会导致严重的畸形。[3] 相比之下，MSCs虽然较为罕见，但由于其高度转移性，导致了约80%的皮肤癌相关死亡。[4]

NMSCs的治疗手段通常包括放射疗法、冷冻疗法、氟尿嘧啶和伊莫喹莫德等局部药物以及外科手术。[5] 而MSCs由于其侵袭性强和转移潜力高，治疗难度更大。局部黑色素瘤的标准治疗方法主要是广泛切除，常结合前哨淋巴结活检来评估疾病进展或晚期/转移性黑色素瘤。系统治疗方法包括BRAF和MEK抑制剂等靶向治疗，以及免疫检查点抑制剂（如抗CTLA-4、抗PD-1和抗PD-L1抗体），这些方法近年来显著提高了总体生存率。[6] 尽管取得了这些进展，治疗耐药性和免疫相关毒性仍然是主要限制因素，因此需要新的治疗策略来提供持久的疗效并减少难治病例的不良反应。

在这种情况下，光动力疗法（Photodynamic Therapy，简称PDT）成为治疗皮肤癌的一种有前景的方法。PDT是一种微创治疗手段，可用于多种疾病，如视网膜黄斑变性、细菌感染、真菌感染和病毒感染等。[7] 除了上述应用外，PDT的主要目标是癌症，具有高选择性和低副作用。[8]

PDT利用光敏剂（Photosensitizer，简称PS）在分子氧存在下被可见光激活，从而产生活性氧（Reactive Oxygen Species，简称ROS）。其中，单线态氧（¹O₂）是主要的细胞毒性物质，主要通过II型途径产生，而I型反应涉及电子或氢转移，产生其他ROS。[9] 理想的PDT光敏剂应具备高效的光吸收、低暗毒性、合适的药代动力学特性、稳定性、可重复性、经济性和高单线态氧量子产率（ϕΔ¹O₂）。姜黄素（Curcumin，简称CUR）是一种来自姜黄（Curcuma longa）的天然黄色色素，因其共轭芳香结构（包含两个带有邻甲氧基的酚环）和在430纳米处的强光吸收而受到关注。[10]

姜黄素具有广泛的生物活性，包括抗氧化、抗菌、抗炎、免疫调节、抗寄生虫和抗真菌作用。[11>特别是在皮肤癌领域，姜黄素已在多种癌细胞系（如C32、G-361、WM 266–4、M21、SP6.5、A375等）中进行了研究，科学证据表明其具有治疗潜力。[12] 研究表明，姜黄素可以影响黑色素瘤的发病机制相关分子和细胞通路，如MST1、JNK、Foxo3、Bim-1、Mcl-1、BCl-2、Bax和JAK-2/STAT-3，使其成为治疗这种癌症的有希望的候选药物。[12]

尽管姜黄素在体外显示出良好的抗癌活性，但由于其在水中的溶解度极低（0.6 μg/mL）、稳定性差、生物利用度低、组织渗透性有限以及代谢和清除速度快，其在临床应用中面临限制。[13> 在这种情况下，将姜黄素用作PDT的光敏剂可以使其在较低浓度下发挥抗癌作用。[14> 然而，其单线态氧量子产率（Φ¹O₂）相对较低，在乙腈中的产率仅为0.11。[15> 因此，提高Φ¹O₂对于增强姜黄素的光动力效果至关重要。最新研究表明，将姜黄素与银纳米颗粒（AgNPs）结合可以显著提升其单线态氧产率，这种现象称为金属增强单线态氧生成（Metal-enhanced singlet oxygen generation，简称ME¹O₂）。[16> 这种组合有望提高姜黄素的光动力活性。

除了将姜黄素与AgNPs结合用于PDT外，另一种提高其生物利用度的策略是使用药物递送系统（Drug Delivery Systems，简称DDS）。脂质体系统因其能够同时包裹疏水性和亲水性药物而成为常用的DDS，具有高度的多样性和生物相容性。[17> 它们的特性（如大小、层状结构、表面性质、脂质组成和内部水相）可以根据具体应用进行定制。[18> 此外，脂质体与生物膜的相似性有助于其与细胞的相互作用。[19]

为了提高稳定性，研究人员开发了含有表面配体的长循环脂质体，通过空间效应增强了其稳定性。三嵌段ABA型共聚物（如Pluronic® F127）因其两亲性结构、高生物相容性和促进跨膜脂质转运的能力而成为有前景的候选材料。[20> 由F127形成的聚合物-脂质混合脂质体比传统脂质体具有更高的稳定性。[21> 这些混合脂质体可以通过固液分散法结合超声处理快速制备，无需挤出步骤。三嵌段共聚物的疏水核心块与脂质双层对齐，促进了稳定的混合脂质体形成，这一过程可以通过“Budding Off”模型解释，即PEO链有助于从较大的“母”脂质体生成较小的“子”脂质体。[21]

因此，本研究旨在开发装载姜黄素和银纳米颗粒的长循环聚合物-脂质混合脂质体，以提高姜黄素的稳定性、溶解度、生物利用度和组织渗透性，并利用ME¹O₂效应用于皮肤癌的PDT治疗。

材料

磷脂1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC，M = 734.04 g mol⁻¹，纯度>99% – CAS 63–89-8）购自Avant Polar Lipids（美国阿拉巴马州）。Pluronic® F127（M = 12,600 g mol⁻¹ – CAS 9003-11-6）、硝酸银、碘化钾、柠檬酸钠、9,10-蒽二基-双（亚甲基）二马来酸（ABDA）和姜黄素（CUR – CAS 458–37-7）、硫罗丹明B（SRB – CAS 3520-42-1）、银标准储备溶液（1000 mg L⁻¹）、Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）和100×

动态光散射（DLS）分析

制备的脂质体的流体动力学直径（HD）、多分散性（Đ）和ζ电位（ζ）数值见表1。

总体而言，所有样品的脂质体分布均显示为单一类型，如图S3（直径分布和相关曲线）所示。此外，DLS分析未使用任何过滤步骤。DPPC-F127混合脂质体的平均HD与de Freitas等人的研究结果一致。[34]

结论

本研究使用聚合物-脂质混合脂质体包裹姜黄素和银纳米颗粒（AgNPs）。通过固液分散法结合超声处理成功制备了DPPC和F127共聚物组成的脂质体系统。银纳米颗粒的合成通过柠檬酸钠还原和室温下的紫外光诱导快速有效地完成。然而，这些颗粒并未完全包裹在脂质体内

作者贡献声明

雅拉·舒文斯基·里肯（Yara Schuvinski Ricken）：撰写初稿、验证、软件应用、方法设计、实验实施、数据分析、概念构建。埃洛亚·拉托切斯基（Eloah Latocheski）：撰写初稿、软件应用、方法设计、实验实施、数据分析。赫洛伊莎·迪尔·多林（Heloisa Diehl Doring）：撰写初稿、软件应用、实验实施、数据分析。道格拉斯·波尔图（Douglas Porto）：软件应用、方法设计、数据分析。乔纳森·保罗·阿格尼斯（Jonathan Paulo Agnes）：撰写初稿、验证、软件应用

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家科学技术发展委员会（CNPq；编号444294/2023-6）对AZF的支持，圣卡塔琳娜州研究与创新基金会（FAPESC）（编号2023TR396、2024TR002588、2024TR002708）以及CAPES（高等教育人员发展协调机构 – 财务代码001）的支持。我们感谢FAPESC为JPA提供的博士后奖学金（项目编号735/2024）。作者还感谢博士