本综述中心思想是，通过农杆菌介导的植物瞬时表达系统，成功在N. benthamiana中生产了重组尘螨主要过敏原Der p 2-Fc融合蛋白，并证实其在体内可诱导强烈的抗原特异性抗体反应，为开发标准化、低成本的特异性免疫疗法（ASIT）和诊断试剂提供了新的技术平台。
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引言：尘螨过敏的挑战与重组过敏原的机遇
屋尘螨（HDM）是导致过敏性鼻炎、哮喘和特应性皮炎等慢性过敏性疾病的主要室内过敏原来源之一。其中，来自Dermatophagoides pteronyssinus的Der p 2是临床上最相关的过敏原之一，高达90%的尘螨过敏患者对其产生IgE致敏。传统的过敏原特异性免疫疗法（ASIT）主要依赖粗制过敏原提取物，这些提取物成分复杂、批次间一致性差，可能导致严重副作用，限制了其安全性和疗效。重组DNA技术的发展为生产高纯度、定义明确的过敏原蛋白提供了可能，这些重组蛋白能够精确模拟天然过敏原的免疫学特性，从而提高治疗的标准化程度和安全性。
在此背景下，植物表达系统，特别是基于烟草（Nicotiana benthamiana）的瞬时表达平台，因其成本效益高、可快速放大、避免人类病原体污染并能进行复杂的翻译后修饰等优势，成为生产疫苗抗原和生物制剂的有前景的替代平台。结合农杆菌浸润和双生病毒（geminiviral）载体的瞬时表达技术，能在数天内实现重组蛋白的高水平积累，非常适合快速生产临床级蛋白。本研究旨在评估利用该平台瞬时表达Der p 2-Fc融合蛋白的可行性及其免疫原性。
材料与方法
表达载体构建与蛋白表达
研究者采用了标准化的国际免疫学会（IUIS）过敏原异构体Der p 2.0101的基因序列。构建了两种植物表达载体：一种是全长Der p 2与人免疫球蛋白G1（IgG1）Fc片段在C端融合（Der p 2-FL-Fc）；另一种是截短变体（Der p 2-TC-Fc），其去除了成熟蛋白的N端区域（P49278的残基1-51），该设计基于已报道的抗原表位定位研究。这两种构建体被克隆到双生病毒植物表达载体pBYR2e中。
所有动物实验均遵循相关机构动物伦理委员会批准的指南进行。将雌性BALB/c小鼠随机分为三组（每组n=5）。对照组注射磷酸盐缓冲盐水（PBS）。在第0天和第21天，实验组小鼠通过肌肉注射（IM）接种10微克植物来源的Der p 2-FL-Fc或Der p 2-TC-Fc蛋白，并辅以明矾（alum）佐剂。在第0天（免疫前）、14天和35天采集血清。通过间接酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清中Der p 2特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度。终点滴度定义为产生OD450值高于临界值（免疫前血清平均OD450+2倍标准差）的最高血清稀释度的倒数。使用两因素重复测量方差分析（ANOVA）进行统计分析。
结果
Der p 2在烟草中的表达与优化
将Der p 2-FL-Fc和Der p 2-TC-Fc构建体导入N. benthamiana叶片后，两种构建体均在浸润部位引发坏死现象。时间进程分析显示，两种融合蛋白的表达在浸润后持续增加，并在6 dpi时达到峰值。在6 dpi时，通过ELISA测定，纯化的重组蛋白产量达到Der p 2-FL-Fc为每克鲜叶重62.4微克，Der p 2-TC-Fc为每克鲜叶重15.5微克。8 dpi时蛋白积累量下降，这可能与组织坏死相关的蛋白降解有关。
蛋白纯化与鉴定
通过蛋白A亲和层析成功纯化了植物生产的Der p 2-FL-Fc和Der p 2-TC-Fc蛋白。SDS-PAGE分析显示，在还原条件下，纯化的蛋白条带与预期的分子量（Der p 2-FL-Fc为45 kDa，Der p 2-TC-Fc为37 kDa）一致。使用抗人IgG Fc-HRP抗体的Western blot分析进一步证实了两种融合蛋白的身份，表明从N. benthamiana叶片中成功表达并纯化了两种Der p 2变体，且纯度高、完整性好。
免疫原性评估
动物实验结果表明，与PBS对照组相比，免疫Der p 2-FL-Fc或Der p 2-TC-Fc的小鼠均产生了显著的Der p 2特异性IgG反应。对于总IgG，两因素重复测量方差分析揭示了时间的显著主效应（F1,8= 60.46, p< 0.001），表明从第14天到第35天，IgG滴度显著增加。构建体间（F1,8= 1.39, p= 0.273）或构建体与时间的交互作用（F1,8= 4.11, p= 0.077）无显著效应。Bonferroni校正后的成对比较证实，第35天的IgG滴度显著高于第14天（p< 0.001）。对于IgG1，也观察到时间的显著主效应（F1,8= 58.15, p< 0.001），其滴度从第14天到第35天显著增加。相比之下，IgG2a反应在时间、构建体或交互作用上均未显示出显著差异。这些结果表明，植物生产的Der p 2-Fc融合蛋白具有良好的免疫原性，可在小鼠体内诱导强烈的抗原特异性体液免疫反应，其特征是总IgG和IgG1随时间显著增加。
讨论与结论
本研究成功地在N. benthamiana中利用双生病毒载体系统瞬时表达了重组尘螨过敏原Der p 2的Fc融合蛋白。与需要发酵优化和放大开发的传统系统相比，植物瞬时表达能够实现快速生产，在短时间内获得纯化蛋白。本研究中观察到的表达水平（高达每克鲜叶重62.4微克）处于该系统的常见报道范围之内。在浸润部位出现的局部坏死现象在高水平瞬时表达研究中常见，可能与内质网应激有关。融合Fc标签旨在增强蛋白稳定性、便于纯化并延长血清半衰期。
免疫学评估表明，植物生产的Der p 2-Fc融合蛋白在免疫后能引发显著的Der p 2特异性IgG反应。研究结果显示时间具有显著主效应，表明加强免疫后抗体滴度升高。未观察到构建体或构建体与时间交互作用的显著主效应，这表明在测试的实验条件下，全长和截短构建体引发了相当的体液免疫反应。这些结果凸显了使用分子定义明确的植物生产过敏原进行免疫疗法的可行性。
综上所述，本研究为利用植物分子农业（plant molecular farming）平台快速生产重组过敏原提供了概念验证。研究结果证实，基于植物的瞬时表达系统是生产具有免疫学活性的重组过敏原蛋白（如Der p 2）的一种可行且有效的策略，为开发用于诊断和潜在临床应用的标准化过敏原制剂奠定了坚实的基础。未来的研究可专注于通过优化表达策略减少植物组织坏死、提高蛋白产量，并进行更全面的体外和体内评估，以在已建立的过敏模型中评估其安全性和有效性，特别是评估Der p 2特异性IgE反应，以更好地确定抗原的致敏潜力。
