1 引言
植物主要依赖两层防御系统抵抗病原体侵袭，即病原体相关分子模式触发的免疫（PAMP-triggered immunity, PTI）和效应因子触发的免疫（effector-triggered immunity, ETI）。在ETI中，绝大多数抗性（R）蛋白属于核苷酸结合位点（NBS）和富含亮氨酸重复序列（LRR）受体，即NLR蛋白，它们通过监控细胞完整性或直接识别病原体效应因子来激活快速的防御反应。典型的CC-NLR（CNL）类蛋白包含一个N端卷曲螺旋（CC）结构域、一个中央NBS结构域和一个C端LRR结构域。其中，LRR结构域主要负责病原体特异性识别，NBS结构域作为分子开关调节蛋白活性，而CC结构域则常参与下游信号转导。许多CNL蛋白的CC结构域自身就能诱导细胞死亡，但关于其单独介导植物抗病性的研究相对较少。由小麦品种Moro和AvS + Yr10 中一个高度同源序列编码的CNL蛋白NLRMoro ，为研究CC-NLR蛋白的调控机制提供了理想模型。本研究旨在剖析NLRMoro 的活性调控机制，特别是其CC结构域的细胞死亡诱导活性以及其他结构域对其的调控作用，以深化对NLR受体自我调控的理解，并为优化作物抗性提供理论基础。
2 结果
2.1 NLRMoro 的CC结构域通过诱导细胞死亡和ROS积累赋予抗性
研究首先发现，在本氏烟和小麦中过表达NLRMoro 或其单独的CC结构域，均能自发激活细胞死亡。而CC与NBS的融合蛋白（CN），或NBS、LRR及其融合蛋白（NL）则不具备此活性。重要的是，定位于质膜的NLRMoro -CC能通过诱导超敏反应（hypersensitive response, HR）、活性氧（reactive oxygen species, ROS）积累和Ca2+ 内流，赋予小麦对条锈病菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici , Pst）的抗性。在过表达CC结构域的小麦转基因株系（CC-OE）中，接种毒性Pst小种CYR32后，病原菌生物量显著降低，且未在无病原菌感染时观察到明显的自发HR病变或生长障碍，表明其在抗病育种中具有潜力。进一步的机制研究表明，CC-OE植株中病程相关（PR）基因表达上调，Pst侵染面积减小，同时HR相关的H2 O2 积累和细胞死亡增加。
Moro CC结构域通过细胞死亡和活性氧积累赋予抗性。">
2.2 NLRMoro 的CC结构域在质膜上寡聚化并促进Ca2+ 内流
亚细胞定位分析显示，CC、CN及全长NLRMoro 蛋白主要定位于质膜。将CC结构域束缚在细胞核内会完全阻断其诱导细胞死亡的能力，表明其质膜定位对其功能至关重要。非损伤微测技术检测发现，在几丁质刺激下，过表达CC的本氏烟叶片和CC-OE小麦叶肉细胞均表现出明显的Ca2+ 内流。通过分裂荧光素酶互补、双分子荧光互补和免疫共沉淀实验证实，全长NLRMoro 及其CC结构域均能发生自我关联（寡聚化）。此外，CC结构域还能与NBS或LRR结构域发生相互作用。
Moro-CC在质膜上寡聚化并促进Ca2+ 内流。">
2.3 NLRMoro CC结构域的EDVID基序是细胞死亡诱导所必需的
CC结构域中保守的EDVID（在NLRMoro 中为EDGID）基序被认为参与分子内相互作用。通过点突变研究发现，同时突变该基序中的三个带负电荷残基（E78A/D79A/D82A，即CC3A ）会显著削弱CC结构域诱导细胞死亡的能力，但对其自我关联、与NBS/LRR的相互作用以及质膜定位没有影响。AlphaFold 3结构预测显示，CC3A 突变导致其五聚体构象中N端和C端的α螺旋向内塌陷，失去了C端特有的漏斗状空腔，这可能是其功能选择性丧失的结构基础。
Moro CC结构域诱导细胞死亡所必需的。">
2.4 CC62-116 是NLRMoro 介导细胞死亡和防御反应的最小活性区域
通过对CC结构域进行N端和C端截短分析，研究将介导细胞死亡的核心区域缩小至第62至116位氨基酸（CC62-116 ）。该最小活性区域自身足以诱导细胞死亡（尽管活性弱于完整的CC结构域），并能赋予小麦对Pst的部分抗性，表现为病原菌生物量减少、PR基因表达上调和ROS积累增加。有趣的是，预测形成卷曲螺旋的两个区域（aa22-56和aa125-145）位于CC62-116 核心区之外，表明卷曲螺旋本身对CC结构域的活性并非必需，但可能具有重要的调节功能。
62-116是NLRMoro 介导细胞死亡和防御反应的最小活性区域。">
2.5 NLRMoro CC结构域的细胞死亡诱导能力受NBS结构域严格调控
单独的CC结构域能诱导细胞死亡，但其与NBS结构域的融合蛋白（CN）则失去了该能力。通过免疫共沉淀、GST pull-down和酵母双杂交实验证实，CC与NBS之间存在直接的蛋白质相互作用。研究发现，NBS与CC的融合（CN）会显著抑制CC的自我关联能力。当NBS与最小活性核心区CC62-116 融合时，同样能阻断后者的活性，表明NBS结构域对CC活性的抑制也作用于其核心区域。
Moro-CC的活性被NBS通过直接的蛋白质相互作用所抑制。">
2.6 NBS和LRR结构域对CC结构域活性的调控涉及分子内相互作用
全长NLRMoro （CC-NBS-LRR）能诱导细胞死亡，而CN（CC-NBS）不能，暗示LRR结构域可能解除了NBS对CC的抑制。然而，当将CC与单独的NBS、LRR或NL结构域共表达时，均不能抑制CC诱导的细胞死亡；同样，将LRR与CN共表达也无法恢复CN的活性。这些结果表明，NBS对CC的抑制以及LRR对NBS抑制的解除，都严格依赖于分子内（即位于同一条多肽链上）的相互作用，结构域的相对位置对其调控功能至关重要。进一步实验发现，LRR能部分削弱NBS与CC之间的相互作用。
Moro-CC的细胞死亡诱导能力影响甚微。">
2.7 NLRMoro 诱导的细胞死亡受CC结构域外的P-loop、RNBS-A和MHD保守基序精确调控
对NBS结构域中关键保守基序进行突变分析发现：1）P-loop基序中保守赖氨酸（K207）突变为精氨酸（K207R）会完全废除全长NLRMoro 的细胞死亡诱导能力；2）RNBS-A基序突变（S231F）和MHD基序突变（D502V）则导致更快、更强的HR细胞死亡。双突变分析表明，RNBS-A的激活效应依赖于完整的P-loop，而MHD的激活效应则基本不受P-loop影响。当将P-loop突变体NBSK207R 与CC结构域在分子间共表达时，出人意料地增强了CC诱导的细胞死亡，这表明K207R突变可能改变了NBS的构象，使其调控模式从分子内抑制转变为分子间增强。蛋白互作实验进一步揭示，NBSK207R 突变不影响其与CC的互作，但显著削弱了其与LRR的互作，表明NBS与LRR的相互作用对于调控NLRMoro 的细胞死亡至关重要。
Moro的细胞死亡诱导能力。">
2.8 S198磷酸化阻断NLRMoro 的细胞死亡诱导能力
质谱分析在NBS结构域的P-loop基序附近鉴定到一个磷酸化位点S198。功能验证显示，模拟磷酸化的突变体NLRMoro S198D 丧失了诱导细胞死亡的能力，而非磷酸化突变体NLRMoro S198A 则与野生型蛋白活性相似。这表明S198位点的磷酸化是维持NLRMoro 处于非活性状态的重要机制。在CN融合蛋白中引入S198D和P-loop K207R双突变，或同时删除S198及P-loop区域，均未能恢复CN的活性，说明S198和P-loop并非NBS物理性阻挡CC功能所必需的位点。
3 讨论
本研究系统剖析了小麦CNL蛋白NLRMoro 的活性调控网络。核心发现是鉴定出CC结构域中一个由55个氨基酸（CC62-116 ）构成的最小活性模块，该模块足以触发HR样细胞死亡并赋予小麦对条锈病的部分抗性，凸显了CC结构域作为核心信号执行单元的作用。该活性区域可能通过与质膜相关组分或特定信号蛋白互作来激活下游防御反应。
研究发现了一个精密的分子内调控回路：NBS结构域通过直接相互作用抑制CC结构域的活性（可能通过阻碍其寡聚化），而LRR结构域则通过竞争性地与NBS结合，解除NBS对CC的抑制。这种“NBS抑制-LRR解抑制”的级联调控模式确保了NLRMoro 在静息状态下的稳定性和在激活时的快速响应。
研究进一步揭示了多个保守蛋白基序和翻译后修饰位点在精细调控中的关键作用。P-loop、RNBS-A和MHD基序分别通过影响核苷酸结合/水解、维持自抑制构象等方式调控蛋白活性。尤为有趣的是，P-loop突变在不同分子背景下（分子内 vs. 分子间）表现出截然相反的调控效果，揭示了其复杂的功能可塑性。此外，毗邻P-loop的S198位点磷酸化被证明是维持蛋白处于非活性状态的“安全锁”，这为理解植物如何防止免疫过度激活提供了新视角。
基于以上发现，研究者提出了一个NLRMoro 自我调控的工作模型。在静息状态，CC结构域的信号核心（红色矩形）因NBS结构域的相互作用（可能由ADP结合和磷酸化状态所稳定）而被屏蔽。当病原体效应因子结合或生理条件改变时，ATP结合和/或去磷酸化导致这些结构域间的相互作用发生改变，从而释放CC结构域，使其能够与下游信号分子（蓝色三角）结合或定位于质膜，最终启动免疫信号传导。
这些发现不仅深化了对CC-NLR蛋白调控机制的理解，也为通过理性设计优化NLR蛋白活性、平衡植物生长与防御的权衡提供了潜在靶点和策略。例如，利用病原体诱导型启动子驱动CC活性区域的表达，或对P-loop、磷酸化位点等调控元件进行工程化改造，有望实现更精准、可控的植物抗病性设计。
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