引言：探索对李痘病毒的持久抗性
李痘病毒（Plum pox virus, PPV）是危害核果类果树最具破坏性的病原体之一，可导致痘病和严重的产量损失。传统上，通过使用经过认证的无病毒种苗以及对病毒具有足够抗性的品种来减轻其危害。然而，在李子中寻找完全抗病的品种非常困难。现有的一些耐病品种虽然自身果实不受损害，但病毒仍可在其体内大量复制并通过蚜虫传播。具有过敏反应的品种（如Jojo）能在初始感染后阻止病毒在植株内扩展。为获得真正的抗性，一个国际科学联盟培育了携带PPV外壳蛋白（CP）基因的转基因（genetically modified, GM）李树，该品系被命名为C5克隆，后称为HoneySweet品种。其抗性机制基于IRSH（反向重复分隔发夹）结构，包含两个被发夹环分隔的PPV CP基因反向拷贝，由一对CaMV35S启动子驱动，可诱导强烈的RNA干扰（RNAi）机制，导致siRNA的形成和目标序列的表观遗传甲基化。
捷克共和国自2001年起开展了针对HoneySweet的长期田间试验，旨在研究其对主要靶标病毒PPV的人工接种抗性。试验还包括了与另外两种常见李子病毒——苹果褪绿叶斑病毒（apple chlorotic leafspot virus, ACLSV）和李矮缩病毒（prune dwarf virus, PDV）的混合感染，以探究多种病毒与转基因李树的互作。本研究聚焦于另一个研究方面，即评估了持续24年的单一或多种病毒感染对这些李树生长和活力的长期影响。
结果：病毒侵染显著抑制生长
在人工接种了不同病毒组合的试验处理中，李树的生长普遍低于未感染的对照组。对树体生长最显著的抑制出现在同时感染三种病毒（PPV + PDV + ACLSV）的处理中。其他处理，即PPV + ACLSV、PPV + PDV以及单独PPV感染，与未感染对照相比也造成了严重的生长抑制。
在测量的参数中，这一事实在树冠体积上表现最为明显。与未感染对照相比，PPV + PDV + ACLSV感染处理的树冠体积小了7.8倍，PPV + PDV处理的树冠体积小了2.5倍，PPV + ACLSV处理的树冠体积小了4倍，单独PPV感染的树冠体积小了2.7倍。在树干横截面积（trunk cross-sectional area, TCSA）方面，包含ACLSV的两个处理（PPV + PDV + ACLSV 和 PPV + ACLSV）的值显著低于未感染对照。PPV + PDV和单独PPV处理的TCSA值与未感染对照组接近。
方差分析（ANOVA）显示，各处理在树冠体积和TCSA两个参数上均存在显著差异。树冠体积的F值为62.83，p = 2.86 × 10−18；TCSA的F值为7.21，p = 1.30 × 10−4。
树冠体积参数显示，处理1（PPV + PDV + ACLSV）的值最低。处理3（PPV + ACLSV）的平均树冠体积是其两倍，但差异不显著。处理2（PPV + PDV）和处理4（单独PPV）的树冠体积显著大于处理1（p < 0.05）。未感染对照（处理5）的树冠体积再次显著增大，并且与所有病毒侵染处理相比，在此参数上均达到了极显著差异（p < 0.001）。
在TCSA参数上，数值最低的两个处理形成一个组——处理1（PPV + PDV + ACLSV）和处理3（PPV + ACLSV）。其余三个处理形成一个组，其成员之间无显著差异（p > 0.05）：处理2（PPV + PDV）、处理4（PPV）和处理5（未感染对照）。处理1与由处理2、4、5组成的组的所有成员均有显著差异。处理3与处理2和处理5有显著差异。
试验中HoneySweet的结果能力
试验中未评估HoneySweet树的结果能力。一方面，由于法规原因无法让果实成熟；另一方面，在整个试验期间，主要由于缺乏合适的授粉树，坐果量极少。尽管试验地附近种植了三棵Jojo李树，但这不足以对超过50棵HoneySweet树进行充分授粉。此外，在试验条件下，Jojo品种的开花时间晚于HoneySweet，可能没有足够的花粉转移到HoneySweet上。相反方向（从HoneySweet到开花较晚的Jojo）的花粉转移似乎也未发生。
讨论：ACLSV是抑制生长的主要因素
该田间试验的主要目的是评估HoneySweet转基因李树对病毒感染的抗性。在试验过程中发现，病毒感染会影响试验树的生长。在HoneySweet转基因李树田间试验中，其同质化的建园条件消除了砧木、品种、年份、地点和农艺措施对树木生长的影响。数据清楚地表明，持续的PPV感染压力，无论是单独还是与其他病毒组合，都会降低HoneySweet树的生长。所有人工接种处理中的树木，其树冠体积均显著低于未感染的对照树。这种生长抑制是永久性的；即使在生长24年后，受感染的树木也未达到未感染对照树的高度。
不同病毒组合处理间的树冠体积存在明显差异。使用三种病毒时观察到最低的生长量。当PPV与ACLSV一起使用时，观察到第二低的生长量。当PPV与PDV一起使用时，树冠体积显著更大。该处理与单独使用PPV获得的树冠体积相同，因此可以得出结论，PDV感染对树木生长没有显著影响。因此，在接种的病毒混合物中使用ACLSV对树冠体积具有最强的抑制作用。
在树干横截面积方面，各处理分为两组，较低TCSA组包括PPV + PDV + ACLSV和PPV + ACLSV处理。其余三个处理，即PPV + PDV、单独PPV和未感染对照，彼此之间没有显著差异。我们再次得出结论，ACLSV与其他病毒组合对试验树的生长有强烈的负面影响。
所监测参数（树冠体积和TCSA）对于评估树木生产力也具有重要意义。根据印度对Santa Rosa李的一项研究，这两个参数对果实产量具有相同的影响。然而，在大多数情况下，这两个参数被分开使用。TCSA被认为是一个更可靠的参数，因为它是在树木下部测量的，那里是树冠形成的条件所在地。此外，作为指标的树冠体积可能受到树木树冠的整形和修剪强度的影响。
为了确定ACLSV和PDV单独对HoneySweet的影响，在试验开始时就将这些处理纳入是合适的。由于该试验主要研究对PPV的抗性，因此开始时未包含不带有PPV的处理。尽管这些处理后来被添加到田间试验中，但由于时间延迟，它们无法在生长评估方面与原始处理进行比较。
HoneySweet转基因李树的试验不仅在其持续时间（24年）上是独特的，在其设计上也是独特的，包含了单一和多种病毒的混合感染。另一个独特之处是同时评估抗性以及病毒对树木生长和活力的影响。关于多种病毒感染对果树生长、产量或抗性影响的已发表研究并不多。例如，在桃树中，李坏死环斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus, PNRSV）和PDV的混合感染具有协同效应，导致桃树矮化病。在樱桃中也描述了这两种病毒的混合感染，与单一感染相比，导致树木营养生长减少。在酸樱桃中，已描述了PNRSV和PNRSV + 樱桃病毒A（cherry virus A）感染对果实中活性化合物含量的影响。对于李子，已有文献关注多重病毒诊断，列出了检测到的病毒、其百分比发生率以及各种病毒组合的发生率。
用各种病毒及其组合人工接种HoneySweet转基因李树的试验结果为该李品种的潜在商业化生产种植提供了建议。结果显示了病毒感染，特别是PPV和ACLSV病毒，对HoneySweet李树的生长和活力具有显著的负面影响。在试验条件下通过嫁接感染性接种物诱导的持续感染压力，在商业种植中可能通过使用受感染的砧木而发生。因此，有必要强调为HoneySweet李树使用经过认证的无病毒砧木的必要性，正如任何其他传统（即未改良）果树上病毒病原体的控制一样。因此，砧木和品种种植材料的认证仍然是控制果树等永久性农作物病毒性疾病的基本方法。使用包括我们所研究的HoneySweet在内的抗性品种的优势在于其对自然病毒感染压力的永久抗性。
材料与方法
试验用树
HoneySweet李树的田间试验包括总共四个具有不同病毒组合的处理和一个未感染对照。所有试验树都在相同条件下同时制备。HoneySweet李接穗来自美国农业部（USDA）的Scorza博士。然后在布拉格Ruzyně的网室中，将其嫁接到准备好的St. Julien砧木上。一龄HoneySweet植株通过嫁接根据试验处理接种病毒。试验中使用了PPV、PDV和ACLSV病毒，因为这些病毒感染在欧洲的李子中发生。病毒接种物来自本机构（捷克食品研究中心布拉格，前身为布拉格作物生产研究所）保存的病毒收集物。接种物枝条取自仅感染目标病毒的树木。通过ELISA和RT-qPCR验证了源树中目标病毒的存在和其他潜在病毒的缺失。
受感染的植株被种植在布拉格Ruzyně国际机场的田间试验地。接种物被保留生长以产生持续的感染压力。在随后的年份中，在叶和花上评估了树木的抗性。所有农艺措施，如修剪、施肥和农药保护，均同等地应用于所有试验植株。树冠形成后，树木不再进行修剪，任其自由生长，因此树木的整体生长和树冠体积仅受一个变量影响，即病毒接种物的存在和组成（一种、两种或三种病毒）。通过每年使用ELISA和RT-qPCR分析叶和花，验证了HoneySweet李树和生长中接种物的病毒存在。同样，每年评估HoneySweet李树和生长中接种物叶片上的症状。在2025年，对单棵树木（当时树龄为24年）的生长进行了评估，这是本工作的主题。
试验环境
除HoneySweet李树外，试验果园还包括许多Karola（对PPV敏感）和Harlayne（对PPV抗性）杏树，最初种植在果园整个周边。这些杏树最初接种了各种PPV株系，用于抗性研究，并作为转基因李树的感染性接种物来源。在试验过程中，Karola杏树被移除，因为感染压力由直接在受感染的HoneySweet李树上生长的接种物维持。试验果园中还最初种植了许多同样接种了各种PPV株系用于抗性研究的Jojo李树。在试验过程中，仅剩下三棵未感染PPV的Jojo树。它们被用于研究转基因花粉向周围植被转移的可能性。试验果园边界之外是布拉格国际机场的草地区域，没有灌木或树木，不可能是病毒接种物的来源，也不会成为转基因花粉的转移目标。
HoneySweet李树生长评估
树干横截面积
对于果树，通常使用树干横截面积（TCSA）来评估生长。我们测量了树干离地面20厘米高处的周长，并根据公式A = C2/(4π)计算了树干横截面积（TCSA, cm2），其中A为面积，C为树干周长。
树冠体积
由于试验处理间存在显著的视觉差异，我们选择树冠体积作为评估树木生长的另一个参数。通过手动测量确定树冠体积。对每株植株，测量了整株高度、树干高度、以及树冠的宽度和厚度。为简化起见，将试验树的树冠比作一个简单的倒置圆锥体，圆锥顶点位于树冠主枝分叉点，圆锥底面为树冠的上平面。根据测得的树冠宽度和厚度值计算底面半径。然后根据圆锥体体积公式V = (1/3) * π * r2* h计算树冠体积，其中V为体积，r为底面半径，h为圆锥高度。
数据分析
使用单因素方差分析（one-way ANOVA）和随后的Tukey检验，评估了各试验处理对测量的树木生长参数的影响。在进行单因素方差分析前，使用Shapiro-Wilk检验评估了每个处理内的正态性。使用Levene检验评估了树冠体积和TCSA的方差齐性。在这两种情况下，方差齐性假设均未被违反（p > 0.05），这证明了使用Tukey HSD进行事后比较的合理性。
