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禽流感A(H5N1)病毒D1.1亚型引发的人感染病例及受体结合特性分析。通过 glycan microarray、固体相位法和生物层干涉法评估发现，所有亚型仍特异性结合禽类α2,3神经节苷脂受体，未出现适应人类α2,6受体的特征，抗原性未显著改变。
2.3.4.4b A(H5N1)流感病毒持续扩大其宿主范围，对公共卫生构成了日益严重的威胁。在不列颠哥伦比亚省诊断出一例由基因型D1.1 A(H5N1)病毒引起的严重人类感染病例，该病毒具有HÀ替换突变。监测循环中的A(H5N1)病毒新变种的受体结合特异性和抗原性非常重要。为了评估这种病毒的潜在人类适应性，我们富集了HA变异亚群，并通过糖链微阵列、固相测定和生物层干涉测量法评估了其唾液酸受体的使用情况。所有变种仅与禽类型唾液酸受体结合。所测试的A(H5N1)变种的抗原性可以被候选疫苗病毒覆盖。
2.3.4.4b高致病性禽流感A(H5N1)病毒前所未有的活跃性，包括其宿主范围的扩大，引起了公共卫生方面的担忧。在加拿大、美国和墨西哥已经报告了2.3.4.4b A(H5N1)病毒的感染病例[1]。截至2025年10月，2.3.4.4b病毒已导致73例实验室确诊的人类感染和2例死亡。北美大多数报告的人类病例都有接触家禽或奶牛的经历[2]。最近在几个国家进行的血清流行病学研究表明，2.3.4.4b A(H5N1)病毒的人类感染被低估了；高风险人群中的实际感染率在2%到7%之间[3-5]。
2024年11月，在不列颠哥伦比亚省报告了一例由基因型D1.1 A(H5N1)病毒引起的青少年女孩的严重感染[6]。从临床样本中测序的感染病毒（A/British Columbia/PHL-2032/2024 [H5N1; BC]）的血凝素（HA）糖蛋白显示了E190D和Q226H（H3编号）氨基酸替换，这两个位置之前被认为与唾液酸受体相互作用有关。尽管在临床样本中E190D的检出率为28%，Q226H的检出率为35%，但它们的存在引发了人们对病毒可能适应人类唾液酸受体的担忧[6]。路易斯安那州一例致命人类感染病例的临床样本中还发现了E190E/D混合突变[7]。
HA 190螺旋结构中的第190位是唾液酸受体结合位点的关键结构元素，它影响受体结合亲和力和病毒抗原性。通过在第190位和第225位获得天冬酰胺来改变受体结合特异性是A(H1N1)大流行的关键因素[8, 9]。评估受体结合特异性对于人畜共患流感病毒的风险评估非常重要。
在这里，我们通过斑块纯化技术鉴定了H5N1病毒的受体结合特异性。我们使用糖链微阵列技术和固相测定法[10]来检测受体使用情况。此外，我们还分析了BC亚群与世界卫生组织推荐的候选疫苗病毒（CVVs）之间的抗原关系。我们从原始临床样本中分离出的病毒株在MDCK（Madine-Darby犬肾）细胞中传代两次后，得到了4个具有HA序列变异的BC病毒亚群。这些病毒亚群的HA序列具有以下氨基酸替换：1) E190；2) D190；3) G159, K169, 和 D190；4) D159, K169, 和 D190，这代表了亲本病毒株的共识序列。我们没有检测到任何含有HA 226H的病毒，并且在亲本病毒株中仅观察到少数（0.5%）这种突变。然而，先前的深度突变扫描显示，在2.3.4.4b HA背景下，226位的组氨酸残基的存在并不影响病毒进入细胞[11]。
根据我们使用的三种测定方法（糖链微阵列a和1b）、固相结合测定c以及生物层干涉测量图1d），所有测试的纯化BC病毒仅与“禽类型”受体（α2,3-唾液酸）结合。与A/Vietnam/1203/2004病毒相比，BC病毒表现出更广泛的受体结合特异性，可以结合α1,3-岩藻糖（例如a H, L）和分裂的N-乙酰-葡萄糖胺（GlcNAc，例如a I, M）。与早期菌株不同，后者主要识别具有α2,3-唾液酸的双臂N-糖链（N-乙酰-半乳糖胺[Gal(β1,4)GlcNAc, LacNAc]），BC病毒则结合含有1或2个唾液酸基团的简单结构（例如a O vs. P）。然而，我们观察到大多数测试病毒对用类似禽类的受体功能化的糖聚合物的亲和力降低图1）。值得注意的是，禽流感病毒完全适应人类不仅涉及获得与α2,6-唾液酸的结合能力，还涉及失去与α2,3-唾液酸的结合能力，这可能是选择这些亚群的一个潜在原因[12]。观察到的亲和力差异不仅反映了病毒与宿主受体的结合情况，还强调了所用合成糖聚合物的性质（包括糖链长度、价态、密度和灵活性）在捕捉病毒结合行为全谱中的重要性[13-15]。无论HA是否有替换，所有病毒都与针对两种测试的CVVs（A/Astrakhan/3212/2020 (H5N8)和A/Ezo red fox/Hokkaido/1/2022 (H5N1)）产生的感染后雪貂抗血清发生反应，表明残基变化对抗原性的影响有限（表S1）。有趣的是，N169 K替换导致的糖基化位点的丢失使病毒对CVV雪貂抗血清的反应性增加了2到3倍。这可能反映了去除糖链屏蔽后附近抗原表位变得更加容易被抗体结合。BC病毒的中和滴度通常在测试的CVVs观察到的3倍范围内（表S2）。
图1. 从不列颠哥伦比亚省分离出的A(H5N1) D1.1变种的受体结合特异性。（a）微阵列上打印的N-糖（A-U）结构。（b）5种A(H5N1)病毒和1种A(H1N1)病毒的糖链阵列结合分析。（c）4种不列颠哥伦比亚省A(H5N1) D1.1变种的固相结合测定。（d）生物层干涉测量法显示不同不列颠哥伦比亚省A(H5N1)病毒对2,3-SLN而非2,6-SLN受体的偏好。具有E190替换的BC病毒对禽类型唾液酸受体的偏好低于具有D190替换的变种。
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