1. 引言
在水产养殖中，化学药物（化疗）传统上被用于预防和控制疾病。然而，化学疗法可能对环境和人类健康产生显著不利影响，包括导致细菌耐药性产生和药物残留。近来，行业趋势逐渐转向使用植物产品替代化学药物来控制水产疾病。天然产物，特别是药用植物及其衍生物，日益被视为水产养殖中抗生素的可行且可持续的替代品。这种转变既能应对细菌耐药性的挑战，也符合消费者对无残留食品的偏好。将植物治疗剂用于疾病管理，可增强罗非鱼养殖的可持续性，并减少对环境的影响。
巴西胡椒树，在巴西俗称Aroeira，属于漆树科，广泛分布于巴西，特别是在大西洋森林地区。该植物的叶子在巴西常用于外敷治疗伤口、促进组织愈合。研究表明，该物种具有广泛的药理特性，包括抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌、抗溃疡和促组织修复等作用。此外，其提取物对多种细菌和真菌（如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等）表现出抗菌活性，其有效性归因于酚类、黄酮类、单萜类等次生代谢产物。
尼罗罗非鱼是一种原产于非洲的淡水鱼，如今已在全球范围内养殖。它是世界第三大水产养殖物种，在过去二十年中产量增长巨大，对改善许多发展中国家的粮食安全起着关键作用。随着水产养殖业快速发展以满足对鱼类蛋白质日益增长的需求，养殖密度和强度增加也提高了疾病暴发的风险。由于目前探讨巴西胡椒树叶乙醇提取物对尼罗罗非鱼影响的文献有限，本研究旨在探究不同浓度的巴西胡椒树叶乙醇提取物对尼罗罗非鱼生长参数和肠道免疫相关基因表达的影响。
2. 材料与方法
本研究的方法获得了实验动物福利委员会的批准。巴西胡椒树叶于2024年开花期在埃及Assiut大学校园内采集。将干燥的叶子粉末用70%乙醇浸渍提取，提取液经旋转蒸发仪浓缩得到粘稠残留物（醇提物）。使用超高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱（UPLC-ESI-MS/MS）在正离子和负离子模式下对该提取物进行化学谱分析。
实验鱼为表观健康的尼罗罗非鱼，在实验室条件下驯化两周后，随机分为四组：对照组（C，饲喂基础饲料）和三个处理组（T0.5%、T1%和T2%），分别饲喂添加了0.5%、1%和2%巴西胡椒树叶乙醇提取物的饲料。饲料通过将相应浓度的提取物乙醇溶液喷洒在基础饲料颗粒表面制备。实验持续60天，鱼每日投喂两次。在投喂开始后的第30天和第60天取样，测定生长性能指标（如最终体重、增重、增重百分比、饲料转化率FCR、特定生长率SGR、肥满度CF、脏体指数VSI和肠胃指数Ga-SI等）并采集前肠样本。
从前肠样本中提取总RNA，反转录为cDNA后，通过实时定量PCR（RT-qPCR）检测促炎细胞因子IL-1β、抗炎细胞因子IL-10和免疫球蛋白IgM基因的表达水平，并以β-肌动蛋白（β-actin）和延伸因子α（EF1α）基因作为内参基因进行标准化。使用GraphPad Prism软件进行统计学分析。
3. 结果
3.1. 巴西胡椒树叶乙醇提取物的化学成分分析
UPLC-ESI-MS/MS分析在正、负离子模式下均检测到33个色谱峰，初步鉴定出多种生物活性化合物。这些化合物包括酚酸（如没食子酸、阿魏酸）、类黄酮（如杨梅素-O-葡萄糖苷、槲皮素3-O-葡萄糖苷）、没食子单宁（如葡萄糖没食子鞣苷、五没食子酰葡萄糖）和三萜类（如乳香二烯酸）等。
3.2. 生长性能、饲料效率和体指标
喂养实验结果显示，与对照组相比，所有处理组的尼罗罗非鱼在最终体重、增重、增重百分比、摄食量、生长率和特定生长率方面均显著提高，且改善程度呈剂量和时间依赖性。饲料转化率在所有添加组中均显著优于对照组，并随剂量和时间增加而改善。实验期间所有组（包括对照组）均未观察到死亡或不良反应，存活率为100%。
具体数据显示，高剂量组（T2%）在60天时，最终体重增至106.9 ± 3.6 g，增重百分比达197.3 ± 3.5%，生长率是之前的两倍多（2.4 ± 0.1），饲料转化率在30天时改善为1.24 ± 0.01。总长度也呈剂量依赖性增加，在60天时T2%组达到最大值（17.1 ± 0.2 cm）。肥满度在最初30天内增加，但在60天时，所有处理组的肥满度值均下降并稳定在最佳水平（2.1 ± 0.0）。大部分处理组的脏体指数和肠胃指数在60天后呈不显著下降趋势，而T2%组的肠胃指数在第60天时显著低于其他所有组和对照组。这些结果表明，提取物促进了更瘦的体型和更高效的肌肉生长。
3.3. 免疫相关基因的表达谱
肠道免疫相关基因的表达呈现剂量和时间依赖性的复杂变化模式。
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IL-1β基因：在投喂30天后，T1%和T2%组的IL-1β基因表达较对照组显著上调，且T2%组高于T1%组。然而，在投喂60天后，仅T0.5%组的IL-1β基因表达被显著上调（是对照组的177倍），而T1%和T2%组的表达水平则下调至与对照组无显著差异。这表明IL-1β的表达呈现双相模式。
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IL-10基因：在30天和60天两个时间点，所有处理组的IL-10基因表达均被显著上调，且上调程度随提取物浓度的增加而增强，呈现出持续、剂量依赖性的抗炎反应增强。
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IgM基因：在投喂30天后，除T0.5%组外，其他处理组的IgM基因表达均显著上调。在投喂60天后，T1%和T2%组的IgM表达仍然显著上调，但T0.5%组的表达则下调至低于对照组和其他处理组。
3.4. 热图与层次聚类分析
基因表达热图可视化显示，在60天时T0.5%组的IL-1β基因表达上调幅度最大（178.76倍变化），在热图中呈现为黄色。其他基因在30天和60天的表达水平变化相对较小，在热图中呈现为蓝色。层次聚类分析热图显示，T1%和T2%组的IL-1β基因表达值与所有处理组的IgM基因表达值聚集在一个主簇中，而所有处理组的IL-10基因表达值与T0.5%组的IL-1β基因表达值聚集在另一个主簇中，反映了不同处理和时间点下基因表达的相似性与差异性。
4. 讨论
本研究结果表明，在饲料中添加巴西胡椒树叶提取物可显著改善尼罗罗非鱼的生长性能、饲料利用效率，并调节肠道免疫反应。这些益处很可能归因于提取物中丰富的生物活性化合物（如酚酸、类黄酮、单宁等）的协同作用。
生长性能的改善与饲料效率的提高相关。例如，提取物中的没食子酸、阿魏酸等酚酸成分已知能改善肠道健康、减少肠道炎症、增强消化酶活性并调节肠道菌群，从而促进营养物质的消化吸收和利用。饲料转化率的降低和特定生长率的提高证实了提取物具有可靠的促生长效果，且效果随时间增强。体指标的变化（如肥满度后期下降，VSI和Ga-SI降低）表明提取物促进了更瘦的体组成，减少了内脏脂肪沉积，这对最大化可食用肌肉产量和减少加工废料是有利的。这与一些已知成分如槲皮素、阿魏酸苯乙酯、齐墩果酸等调节脂质代谢、减少脂肪堆积的作用相符。
在免疫调节方面，提取物对IL-1β基因表达的双相调节模式（低剂量长期刺激后显著上调，中高剂量后期恢复正常或下调）可能与生物活性成分（如没食子酸）的累积相互作用有关。IL-10基因的持续上调表明提取物能够增强抗炎通路。而IgM基因的上调（除了长期低剂量组）则支持了提取物对体液免疫的增强作用。这些免疫调节作用可能通过抑制NF-κB和p38 MAPK等信号通路来实现，有助于维持肠道免疫稳态，减少炎症损伤，从而间接支持生长。
总而言之，提取物中多种生物活性化合物的协同作用共同解释了观察到的生长性能提升和肠道免疫平衡的优化。这种多靶点效应是单一化合物难以实现的。
5. 结论
本研究首次全面评估了巴西胡椒树叶乙醇提取物作为尼罗罗非鱼膳食补充剂的效果。UPLC-ESI-MS/MS分析鉴定出丰富的生物活性代谢物谱，这些成分与体内生长和肠道免疫反应的改善直接相关。2%（w/w）的添加水平和60天的投喂时长产生了最佳效果，包括高达197.3 ± 3.5%的增重百分比、1.6%的特定生长率提升、饲料效率改善、更瘦的体型以及有利于体液免疫和减轻炎症的免疫调节作用，且未观察到不良影响。该提取物为可持续的尼罗罗非鱼养殖提供了一种有前景的天然饲料添加剂，能够同步改善生产性能和肠道健康。然而，建议进行大规模田间喂养试验，以在商业养殖条件下验证这些发现。
