3.1. 方法建立
在确立仪器配置时，综合考虑了各检测器的基本特性。电雾式检测器与质谱均为破坏性检测器，其响应分别依赖于质量和浓度。采用分流（9:1）将大部分柱后流出物导向电雾式检测器。由于辅助泵流路死体积较小，设置了4.8分钟的延迟以校正驻留体积差异。该辅助流路不仅能为检测器提供稳定的流动相组成，还通过最大化进入电雾式检测器的有机改性剂比例来提高雾化过程中的分析物传质效率，从而增强灵敏度。为获得稳定的信噪比，减小并稳定电雾式检测器背景电流至关重要，因此需仔细选择试剂纯度和缓冲液浓度。所用流动相是亲脂性藻毒素分析中常用甲酸/甲酸铵缓冲液的一种改良版本，其浓度减半，实现了约1-2 pA的背景电流。进一步降低缓冲液浓度会对色谱性能产生负面影响。研究发现，在无样品进样时的色谱图中观察到的杂质来源于流动相试剂中的杂质以及在分析和运行再平衡过程中在柱上富集的系统污染物。为降低这些杂质峰的强度，尝试了多种方案，包括利用切换阀，在分析柱前放置C18保护柱，以便在下次进样前的再平衡过程中捕获流动相污染物，但仍有低水平杂质被检出。最终，在流动相制备中采用新鲜试剂、充分清洗玻璃器皿以及缩短方法再平衡时间等最佳实践，是减少基线杂质最有效的手段。考虑到仪器配置包含两台泵和三个检测器，使用质量控制样品RM-RILC来评估系统适用性，并在适当时评估特定的方法性能指标。该保留指数标准品含有20种不同烷基链长的N-烷基吡啶-3-磺酸盐，它们在整个色谱梯度中以一系列峰的形式洗脱，易于被电雾式检测器检测，其各NAPS峰面积相对标准偏差范围为2.8%至6.4%（平均3.9%）。为提高对低浓度样品（低μg mL–1）的检测能力，建立了大体积进样程序，并通过对比不同浓度和进样体积下RM-RILC的响应，验证了进样程序的准确性。
3.2. 性能特征
所选色谱柱、流动相和梯度程序为不同毒素类提供了良好的分离。虽然上述措施最大限度地降低了基线噪音并消除了一些背景干扰，但标准物质本身痕量水平的杂质也存在干扰风险。例如，一些杂质在AZAs（azaspiracids）附近洗脱，因此采用较低的进样体积来减小相对峰面积并改善分离度。使用各类毒素的代表性分析物，该方法在柱上的检测限估计为≤2.0 ng。评估了包括线性、二次曲线和对数-对数线性在内的多种校准模型。结果显示，在定量限以上水平，所有测试的电雾式检测器校准模型均观察到高达±5%的偏差，并且残差图显示出系统性趋势，这表明在高精度定量中需谨慎选择校准策略。本研究选择使用信号强度匹配的标准品进行单点校准，以最大限度地减少偏差。检测器的功率函数值设置可用于线性化响应，但在本工作中，增加该值会降低灵敏度。通过为每种分析物选择进样体积，使其在柱上输送约100 ng，评估了中间精密度。实验计算了各分析物相对于冈田酸的归一化相对响应因子。单个分析物的归一化相对响应因子相对标准偏差在1.6%至8.5%之间（平均4.6%），同类毒素间在5.0%至11%之间，而所有毒素间的归一化相对响应因子相对标准偏差为13%，表明不同分析物类别之间存在响应差异。这一变异性与文献报道一致。对于叶藻毒素、鳍藻毒素、扇贝毒素和azaspiracids等多醚衍生物，其响应因子的一致性（5.0-5.7%相对标准偏差）在单个毒素的观察范围内，表明这些细微的结构修饰不会引起可检测的电雾式检测器响应变化。微囊藻毒素和nodularin的较高变异性（7.1%相对标准偏差）可归因于某些结构中存在不同数量的精氨酸残基，这些残基在所用流动相pH下带正电荷，能与流动相中的甲酸根离子配对，导致观察到的响应更高。然而，将微囊藻毒素按所含精氨酸残基数量相同进一步分组后，一致性得到显著改善。与azaspiracids类似，环亚胺类毒素在分析条件下带有正电荷，这在一定程度上解释了其相对于中性化合物的较高归一化相对响应因子。环亚胺类毒素表现出最高的类内变异性（11%相对标准偏差）；但需注意，这些毒素通常仅基于共享的环亚胺基团进行分类，而其他结构差异显著。spirolides和pinnatoxins的结构最为相似，而gymnodimine在大小和原子连接性上则有明显差异。若排除gymnodimine，其他环亚胺类毒素之间的归一化相对响应因子一致性很好（4.2%相对标准偏差）。
3.3. 纯度评估
对于来源材料稀缺的天然产物，纯度评估通常结合多种方法进行，重点是表征可检测的杂质并确定这些杂质是否会干扰标准物质的定值或使用。这与通常用于纯物质有证标准物质的方法有根本不同，后者需要对杂质进行定量并认证物质的纯度。本文将所建立的方法应用于评估候选MC-LA有证标准物质储备液中的杂质。将储备液稀释10倍后进样0.1 μL，使MC-LA峰面积降至与未稀释MC-LA标准物质储备液进样中检测到的杂质水平相当。这有助于最大限度地减少校准偏差，使化合物间响应因子的差异成为最大的剩余不确定度来源。结合电雾式检测器、二极管阵列检测器和质谱的多检测器配置提供的数据有助于确定观察到的杂质是否在结构上相关。在16分钟（1）和17分钟（2）处检测到两个杂质峰，其峰面积相对于MC-LA小于0.5%。全扫描质谱数据显示，峰1是两个共洗脱的杂质，其加合物分布与MC-LA相似。与MC-LA的质荷比差异表明，其中一个是脱水MC-LA，另一个是可能在50%甲醇储存过程中形成的甲酯。峰2的加合物分布与MC-LA不一致，并且显示出不同的紫外吸收谱，表明其与MC-LA的结构相似性较低。虽然此示例中检测到的杂质处于痕量水平，但它说明了电雾式检测器结合其他检测器的互补数据如何用于纯度评估，在杂质干扰用于定量的积分信号时，为准确校正定量核磁共振等技术的测量结果提供了一种有效方法。
3.4. 稳定性监测
根据国际标准，稳定性监测实验的基本评估为：|xCRM- xmon| ≤ k√(uCRM2+ umon2)，其中xCRM和xmon分别是认证浓度和监测实验确定的浓度，k是95%置信区间的覆盖因子，uCRM和umon分别是有证标准物质和监测方法的标准不确定度。归一化相对响应因子的重现性在不同运行之间表现一致，可用于有证标准物质整个生命周期的监测，评估公式可调整为：|nRRFx- nRRFx mon| ≤ k√(unRRFx2+ unRRFx mon2)。其中，nRRFx是通过性能评估研究确定的分析物x的平均归一化相对响应，其不确定度unRRFx2是重现性试验中nRRFx结果的方差，而nRRFx mon是经过冈田酸归一化的监测测量值，其不确定度unRRFx mon2代表nRRFx mon测定的方差。这两个方差项的值可通过将冈田酸和分析物x两者的精密度估计值（即相对相对标准偏差）以平方和形式组合得到。通过使用RM-RILC的平均重复性估计值可以更稳健地估算这些方差项，因为RM-RILC在整个保留时间范围内有14个峰洗脱，并且在每个序列中多次进样。例如，当使用此不确定度估计值代表冈田酸和分析物测量的精密度时，方差项可进一步简化为unRRFx mon2≈ √(2uRSDr2)。对选定有证标准物质超过8年监测期的控制图表明，该方法适用于长期稳定性监测。
3.5. 定量
利用液相色谱-电雾式检测器，以结构紧密相关的毒素类似物有证标准物质作为校准品，对校准溶液有证标准物质进行表征。在将储备液稀释至最终安瓿浓度之前，通过1H定量核磁共振采用苯甲酸或咖啡因外标法对储备液进行认证测量。液相色谱-电雾式检测器可在最终有证标准物质单位浓度下提供测量数据，这在没有上一批次有证标准物质用于液相色谱-质谱法校准的情况下尤其有用。对五种藻类和蓝藻毒素候选有证标准物质进行的液相色谱-电雾式检测器与定量核磁共振结果对比显示，两者高度一致。这些结果为更广泛地应用液相色谱-电雾式检测器进行定量提供了良好前景，前提是仔细选择结构相似的校准品并使用单点匹配上柱质量进样。
综上所述，液相色谱-电雾式检测器在天然毒素校准溶液有证标准物质的开发、表征和稳定性监测的多个阶段均展现出重要应用价值。该方法适用于均质性研究和稳定性研究，其归一化相对响应因子的重现性表明该方法适用于藻类和蓝藻毒素有证标准物质的认证后监测。工作强调了评估电雾式检测器所用校准模型以最大限度减少校准偏差的重要性，其中单点匹配水平校准是一种有效策略。结合二极管阵列检测器和质谱的多检测器配置，为候选有证标准物质的纯度评估提供了额外优势。最后，该方法成功应用于来自五个不同毒素类别的新校准溶液有证标准物质的表征，结果与定量核磁共振测量值高度吻合。该方法普遍适用于样品稀缺的天然产物校准溶液标准物质的开发和表征。
