超声敏化细菌杂交系统：突破肿瘤免疫耐受，增强乳腺癌声动力免疫治疗新策略

为了解决活菌免疫疗法缺乏特异性、长期定植易致免疫耐受，以及肿瘤免疫抑制微环境限制免疫治疗效果的难题，本研究构建了由含锰卟啉金属有机框架（Mn-MOF）修饰大肠杆菌Nissle 1917形成的细菌声敏剂杂交系统（HA@Mn-MOF@E）。该系统借助细菌缺氧趋向性靶向定植肿瘤，在超声作用下，协同诱导细菌和肿瘤细胞死亡，释放的锰离子与外源性双链DNA共同激活cGAS–STING通路，从而高效激活抗原呈递细胞，增强抗肿瘤免疫应答，显著抑制原位乳腺肿瘤进展。这项工作为活微生物诱导的免疫治疗提供了一种声动力敏化的新范式。

癌症，尤其是高度异质性的实体瘤如乳腺癌，一直是医学领域的巨大挑战。免疫疗法的兴起为癌症治疗带来了革命，它旨在唤醒人体自身的免疫系统来识别和清除肿瘤。然而，肿瘤细胞善于伪装，它们能通过表达多变的表面抗原来“逃逸”免疫监视，同时在肿瘤内部营造一个高度免疫抑制的微环境，这使得单一疗法常常“力不从心”，响应率不高。近年来，利用活体微生物（如益生菌）来调节肿瘤免疫的策略受到关注。这些“细菌小分队”能够凭借对肿瘤内部缺氧环境的天然趋向性，特异性地定植于肿瘤深处，并通过其表面的脂多糖等成分持续激活机体的天然免疫反应。但问题也随之而来：这种由细菌引发的免疫反应往往缺乏肿瘤特异性，属于“广谱激活”；更棘手的是，细菌在肿瘤内长期“驻扎”，持续的慢性炎症刺激反而可能导致免疫细胞耗竭，最终诱发免疫耐受，让治疗前功尽弃。

为了破解这一困局，并充分利用超声治疗能诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡、原位提供肿瘤抗原的优势，来自上海交通大学医学院附属瑞金医院的研究团队在《Acta Pharmaceutica Sinica B》上发表了一项创新研究。他们巧妙地将两种策略合二为一，设计并构建了一种“细菌声敏剂杂交系统”，旨在通过超声“定点爆破”的方式，在清除细菌和肿瘤细胞的同时，最大化地释放免疫刺激信号，从而彻底激活肿瘤内的抗原呈递过程，实现精准、强效的免疫治疗。

为了验证这一设想，研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：首先，他们通过水热合成法制备了含锰的卟啉基金属有机框架纳米颗粒，并利用电荷相互作用将其修饰到益生菌表面，构建了HA@Mn-MOF@E杂交系统。其次，利用透射电镜、X射线光电子能谱、流式细胞术等多种表征手段，系统分析了该杂交系统的形貌、元素组成、荧光特性及细菌活性。在体外，研究采用了细胞活力检测、流式细胞术分析细胞凋亡、活性氧检测等方法，评估了超声诱导的细胞毒性和免疫激活效应，并检测了cGAMP水平及相关蛋白磷酸化表达。在体内，他们建立了小鼠原位和皮下乳腺癌模型，通过活体成像技术追踪细菌和材料在体内的分布与定植，并利用流式细胞术分析肿瘤组织和淋巴结中各类免疫细胞的比例变化，通过免疫组化和PCR检测肿瘤微环境的免疫状态。最后，通过监测肿瘤体积、小鼠生存期以及组织病理学染色，全面评估了该治疗系统的抗肿瘤效果。

3.1. 杂交细菌系统的制备与表征

研究人员成功合成了双金属MOF纳米颗粒，并将其通过简单的混合方法修饰到带负电的大肠杆菌Nissle 1917表面，然后用透明质酸包裹，最终得到HA@Mn-MOF@E。表征结果显示，Mn-MOF成功均匀包覆在细菌表面，引入了锆和锰元素，且该修饰过程对细菌活性及生长影响很小，证明了该杂交系统具有良好的生物相容性。

3.2. 超声诱导的体外细胞毒性

作为活的声敏剂，HA@Mn-MOF@E在超声作用下能有效杀灭细菌和肿瘤细胞。2 ultrasound for 5 min and (B) statistical data (n = 3); (C, D) Quantitative analysis and (E) representative flow cytometry plots of cell apoptosis with staining of APC-annexin V and PI, after 4T1 cells treated with PBS, ECN, HA@Mn-MOF, HA@Mn-MOF+US or HA@Mn-MOF@E+US (n = 3); (F) Cell viability of 4T1 detected using CCK-8 (n = 4); (G) Confocal microscopy images of 4T1 cells for live and dead staining. Scal bar = 50 μm. Data are presented as mean ± SD. Statistical analysis was carried out by means of one-way ANOVA. P < 0.01;P < 0.001;***P < 0.0001.">实验表明，超声处理首先导致细菌死亡，并促进其释放的双链DNA和Mn²⁺进入肿瘤细胞。与单纯材料加超声组相比，HA@Mn-MOF@E在超声后能更显著地诱导肿瘤细胞早期和晚期凋亡，几乎杀死所有肿瘤细胞，这归因于细菌携带的声敏剂能更有效地沉积在细胞表面，并产生单线态氧。

3.3. 抗原呈递细胞的体外激活

肿瘤免疫耐受的关键在于抗原呈递细胞难以被激活。Mn²⁺能增强cGAS（环鸟苷酸-腺苷酸合成酶）对双链DNA的识别，从而激活cGAS–STING通路。+ DC after DC cells treated with PBS, ECN, HA@Mn-MOF, HA@Mn-MOF+US, and HA@Mn-MOF@E+US. Data are presented as mean ± SD. Statistical analysis was carried out by means of one-way ANOVA. *P < 0.05; P < 0.01;P < 0.001;***P < 0.0001.">体外实验显示，经超声处理的HA@Mn-MOF@E能高效地将巨噬细胞极化为CD86⁺的M1型，并显著提升树突状细胞上CD80⁺和CD86⁺的比例。同时，该处理显著上调了炎症因子（Tnf-α, Il-6, Ifn-β）及相关基因的表达，增加了细胞内cGAMP水平，并促进了STING通路下游关键蛋白TBK1和IRF3的磷酸化。这表明，超声触发的细菌碎片、Mn²⁺和肿瘤细胞免疫原性死亡（ICD）共同作用，能通过刺激STING通路有效激活抗原呈递细胞。

3.4. 肿瘤靶向定植

为实现有效治疗，治疗剂在肿瘤内的富集与分布至关重要。5 CFU to mice bearing 4T1 orthotopic tumors. Meanwhile, the same amount of HA@Mn-MOF was injected into tumors. (A) Fluorescence imaging (633 nm) from porphyrins in MOF during 72 h and (B) quantitative statistical results (n = 5); (C) Bioluminescence imaging of major tissues at 72 h and (D) quantitative statistical results (n = 5). (E) Plate photos and (F) quantitative statistical results of bacterial number in blood and major tissues (n = 5) at 72 h after intratumoral injection of ECN and HA@Mn-MOF@E. Data are presented as mean ± SD. Statistical analysis was carried out using an unpaired Student’s t-test. *P < 0.05; ****P < 0.0001; ns represented not significant.">研究证实，凭借大肠杆菌的缺氧趋向性，无论是瘤内注射还是静脉注射，HA@Mn-MOF@E都能在肿瘤部位特异性地富集和定植，其携带的Mn-MOF在肿瘤内的滞留时间远长于游离的材料，而表面工程化修饰并未显著影响细菌本身的肿瘤靶向能力，这为后续的超声治疗提供了理想的时间窗口和空间分布。

3.5. 体内免疫激活

在复杂的乳腺癌免疫微环境中验证其免疫激活效果。+CD8⁺T cells and (D) the proportion of CD86⁺DC in the lymph nodes (n = 5), the tumor relative gene expression levels of inflammatory factors (E) Tnfa, (F) Cd206, (G) Il6, and STING pathway related genes including (H) Ifnb, (I) Isg, and (J) Ccl5 were determined (n = 5). (K) Immunofluorescence staining of tumor tissue, green for CD3⁺T cells and red for CD8⁺T cells; scale bar = 40 μm. Data are presented as mean ± SD. Statistical analysis was carried out by means of one-way ANOVA. *P < 0.05; P < 0.01;P < 0.001;***P < 0.0001; ns represented not significant.">体内实验表明，超声处理后的HA@Mn-MOF@E能显著增加肿瘤内CD3⁺T细胞的比例和M1/M2型巨噬细胞比值，提升淋巴结中IFN-γ⁺CD8⁺效应T细胞和CD86⁺树突状细胞的比例。同时，肿瘤组织中炎症因子及STING通路相关基因的表达也显著上调，免疫荧光染色也观察到更多CD3⁺和CD8⁺T细胞浸润。这证实了该系统能协同细菌和Mn²⁺的双重免疫激活作用，增强肿瘤局部的炎症反应和淋巴结的免疫应答。

3.6. 体内抗肿瘤效果

最终，在乳腺癌原位模型中评估其治疗潜力。实验结果显示，HA@Mn-MOF@E结合超声治疗能最有效地抑制肿瘤生长，部分小鼠肿瘤完全消失，并显著延长生存期。在治疗结束后的小鼠中，对侧再次接种肿瘤的挑战实验显示，部分小鼠获得了免疫记忆，能够抵抗肿瘤的再次生长。组织病理学分析显示，治疗组肿瘤出现大量细胞核碎裂、凋亡细胞增加，增殖标志物Ki67阳性细胞几乎消失，表明肿瘤处于坏死状态。通过静脉给药也观察到了类似的强效抗肿瘤效果。所有治疗组均未观察到明显的器官毒性。

综上所述，本研究成功构建了一种新型的细菌声敏剂杂交系统HA@Mn-MOF@E。该研究的主要结论和重要意义在于：它创新性地将活微生物的肿瘤靶向定植能力与声动力治疗的免疫激活优势相结合。该系统不仅解决了活菌疗法特异性不足、易致免疫耐受的难题，还通过超声“按需”裂解细菌和肿瘤细胞，在释放大量肿瘤抗原的同时，协同释放能强力激活cGAS–STING通路的细菌双链DNA和锰离子，从而实现了对抗原呈递过程“从源头到终点”的彻底激活。实验证明，该策略能高效重塑肿瘤免疫微环境，促进效应T细胞浸润和活化，最终在乳腺癌模型中展现出卓越的肿瘤抑制效果，并可能诱导产生长期的免疫记忆。这项工作由Haiyan Guo、Yuhan Li、Xue Chen、Xiuru Ji、Zeyang Liu、Hongjing Jiang、Han Wang和Dalong Ni合作完成，为活微生物介导的肿瘤免疫治疗提供了一种全新的“声动力敏化”范式，也为开发超声增强的肿瘤免疫联合疗法提供了一个极具前景的组成模型，具有重要的临床转化潜力。