附属蛋白和辅因子在调控黑素皮质素-4受体信号传导中的作用：最新进展
1. 引言
黑素皮质素-4受体（MC4R）是A类G蛋白偶联受体（GPCR），主要表达于下丘脑室旁核（PVN），在黑素皮质素-瘦素通路中扮演着调节食欲和能量稳态的核心角色。MC4R的独特之处在于它既有内源性激动剂（如源自阿片皮质素原（POMC）的α-黑素细胞刺激素（α-MSH）和β-MSH，可抑制食欲），也有内源性拮抗剂（刺鼠相关蛋白（AgRP），可促进摄食）。Mc4r基因敲除会导致小鼠产生贪食性肥胖，而在人类中，使MC4R失活的基因变异会导致严重的早发性肥胖。针对MC4R通路的合成激动剂（如setmelanotide）的开发，证明了药理学靶向该通路是可行的。本综述旨在总结关于MC4R信号转导方式的新见解，重点关注包括其他膜蛋白、无机辅因子和运输蛋白在内的附属蛋白如何调控MC4R功能，并简要介绍可能直接与受体结合的新内源性激动剂。
2. 当前对MC4R信号传导的理解
GPCR通过四种G蛋白信号通路传导信号：激活腺苷酸环化酶以增加cAMP的Gs、抑制腺苷酸环化酶的Gi/o、刺激磷脂酶C以动员细胞内钙库的Gq/11以及激活RhoA介导细胞骨架重排的G12/13。GPCR脱敏发生在β-抑制蛋白募集并通过网格蛋白介导的内吞作用内化时。细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）通路可被多种G蛋白或β-抑制蛋白通路下游激活。据报道，MC4R在细胞中能与所有四种G蛋白信号通路偶联，尽管Gs-cAMP信号通路特征最为明确，且受MC4R突变损害。研究表明，MC4R-Gs信号主要调节能量消耗、心血管功能和葡萄糖耐受，而MC4R-Gq/11信号则介导食物摄入、胆固醇水平和体长的变化。合成激动剂setmelanotide激活Gq/11信号的能力强于α-MSH，其较少的副作用被归因于这种偏向性信号传导。
s-腺苷酸环化酶通路增加cAMP，并利用Gq/11-磷脂酶C（PLC）通路将磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）水解为二酰甘油（DAG）和肌醇1,4,5-三磷酸（IP3）。">
此外，一部分与较低BMI相关的保护性MC4R变体显示出对β-抑制蛋白募集和MAPK信号增强的信号偏向，这可能源于内体膜，但需要进一步研究。
MC4R在纤毛上的定位
MC4R在神经元初级纤毛上的定位对其信号传导至关重要。MC4R与腺苷酸环化酶3型（ADCY3，其自身突变也与单基因肥胖有关）在下丘脑神经元的初级纤毛上共定位。一部分位于受体第三细胞内环（ICL3）的、与人类肥胖相关的MC4R突变会损害其纤毛定位。在MC4R表达细胞中缺失功能性纤毛的小鼠表现出与全身MC4R敲除小鼠类似的严重肥胖。表达MC4R的纤毛也会随着年龄增长而缩短，这与能量消耗减少、食欲增加和肥胖发展有关。尽管MC4R在初级纤毛上的定位很重要，但在自由摄食条件下，成年大脑中MC4R的纤毛表达水平较低。研究表明，MC4R从纤毛的持续耗竭是由β-抑制蛋白依赖的泛素化驱动的，而逆激动剂AgRP能够抑制这种纤毛退出过程。
3. 配体和二价离子辅因子对MC4R信号传导的调控
MC4R的早期结构研究揭示，钙离子（Ca2+）是α-MSH和NDP-MSH等激动剂结合和效力的关键辅因子。Ca2+结合由MC4R内三个保守的带负电荷残基（E2.60, D3.25, 和 D3.29）以及配体的残基协调。Ca2+在配体与MC4R的TM2和TM3之间形成连接。Ca2+提高了setmelanotide的效力，但对AgRP或其他MC4R拮抗剂影响甚微。当这些钙离子配位残基发生突变时，会降低MC4R在生理Ca2+浓度下对α-MSH和setmelanotide的效力并导致肥胖。Setmelanotide与Ca2+和MC4R的TM3残基形成独特的相互作用，这有利于与NDP-α-MSH相比时的受体激活。其他二价离子（如Zn2+）可能调控MC4R的组成型活性。
4. MC4R的寡聚化
MC4R在转染的HEK293细胞中已被证明可通过多种技术发生同源寡聚化。其寡聚机制尚不完全清楚，但不涉及二硫键。一些研究表明，阻止MC4R寡聚化的突变会导致受体信号增强，推测MC4R寡聚体解离为单体可能增加信号传导能力。然而，许多与肥胖相关且导致受体活性降低的MC4R突变也被证明会破坏MC4R同源二聚化，但这些突变也影响了MC4R信号传导的其他方面，因此难以将二聚化减少与活性降低直接关联。此外，MC4R与多种其他GPCR的相互作用在细胞研究中也有报道，但其生理意义尚未得到充分研究。
5. 其他跨膜蛋白的调控
5.1 内向整流钾通道（Kir）
一个不依赖于G蛋白的MC4R信号通路涉及内向整流钾通道1.7（Kir7.1），该通路被证明可调节能量稳态。研究表明，α-MSH诱导的Kir7.1关闭和AgRP打开Kir7.1通道，可调节PVN神经元的动作电位发放。修饰后不能与Gαs相互作用的MC4R仍能与Kir7.1偶联。在MC4R表达细胞中条件性敲除Kcnj13（编码Kir7.1）的小鼠，其下丘脑脑片表现出有缺陷的α-MSH诱导的MC4R PVN神经元去极化。Kir7.1与MC4R的偶联对于介导多种药物对进食和体重增加的影响很重要。MC4R和Kir7.1是否形成直接复合物尚无定论，预测的相互作用界面涉及MC4R的TM5、ICL2和ICL3与Kir7.1的细胞内界面。此外，MC4R还被证明可负调控Kir2.1的表达，这可能影响胰岛素敏感性。
5.2 黑素皮质素-2受体附属蛋白2（MRAP2）
MRAP2是一种单次跨膜蛋白，在大脑中高表达，并在多项研究中被证明可促进MC4R信号传导。全局性和大脑特异性Mrap2敲除小鼠会出现肥胖，与Mc4r敲除小鼠类似，进一步证明MRAP2调控MC4R活性。此外，使MC4R功能失活的罕见MRAP2变体在人类群体中与肥胖和超重相关。然而，MRAP2也调节其他GPCR，这解释了为何同时缺失Mrap2和Mc4r的小鼠表型不如单独缺失Mc4r严重。研究表明，MRAP2主要通过减少β-抑制蛋白-2向MC4R的募集、降低MC4R的组成型和配体介导的内化，从而增加细胞表面活性受体的数量。此外，MRAP2是MC4R在纤毛上富集所必需的。
5.3 证据有限的跨膜蛋白
视蛋白3受体（OPN3）是一种与Gi/o信号通路偶联的GPCR，与MC4R共表达于小鼠大脑PVN。OPN3的组成型活性负向调控MC4R的cAMP信号并增强Kir7.1活性。OPN3与MC4R和Kir7.1共免疫沉淀，提示三者可能形成复合物。单羧酸转运蛋白8（MCT8）是一种甲状腺激素转运蛋白，也与MC4R共表达于下丘脑神经元。相互作用实验表明MC4R和MCT8可能存在相互作用，MCT8降低了MC4R介导的Gq信号传导，但不影响Gs信号传导，其机制尚待探索。
6. 主要影响MC4R细胞表面表达或运输的调控因子
6.1 DENN结构域包含蛋白1B
DENND1B的变异最近通过无偏基因组学方法被确定与犬类和人类肥胖表型相关。DENND1B对Rab35和Rab15具有鸟苷酸交换因子（GEF）活性，参与网格蛋白介导的内吞作用。在HEK293细胞中，DENND1B的过表达减少了cAMP信号并增加了激动剂诱导的MC4R内化，而其敲低则产生相反效果。DENND1B和Rab35在MC4R纤毛功能中的作用仍有待探索。
6.2 内质网分子伴侣
内质网应激和未折叠蛋白反应（UPR）的激活会通过多种机制加剧高脂饮食动物的肥胖。热休克同源蛋白70（Hsc70）和葡萄糖调节蛋白78（GRP78）等内质网分子伴侣已被证明可调控MC4R活性。Hsc70可增加突变型MC4R的表面表达和信号传导，但对野生型表面表达无影响。GRP78被鉴定为与MC4R ICL3相互作用的蛋白，其敲低减少了MC4R内化和cAMP信号。然而，GRP78调控MC4R的生理相关性仍有待确定。
6.3 Mahogunin环指蛋白1和Attractin样蛋白1
Mahogunin环指蛋白1（MGRN1）是一种膜锚定的E3连接酶，参与泛素化和内体-溶酶体运输。MGRN1与跨膜蛋白ATRN或ATRNL1形成复合物时发生泛素化，参与MC4R从纤毛的退出。ATRNL1最近被证明可与MC4R相互作用，并通过减少β-抑制蛋白募集来增强MC4R介导的cAMP信号。小鼠PVN中Atrnl1的缺失会增加食物摄入和体重增加，且无法被MC4R激动剂治疗挽救。罕见的损害MC4R信号传导的ATRNL1基因变异已在早发性肥胖儿童中发现。
6.4 C2CD5
钙和脂质结合的C2结构域蛋白（C2CD5）最近被鉴定为可调控MC4R运输。C2CD5在PVN的MC4R阳性细胞中表达。小鼠C2CD5敲除会导致肥胖并伴有能量消耗减少，且这些小鼠对直接注射到PVN的MC4R激动剂治疗产生抵抗。在细胞中过表达C2CD5可增强MC4R内化，但缺少C2结构域的突变体对cAMP信号无影响，其具体机制尚不清楚。
7. 新型内源性激动剂
7.1 脂钙蛋白-2（LCN2）
脂钙蛋白-2最初被描述为一种脂肪因子，对小鼠和灵长类动物具有厌食作用，后来在骨组织中发现由成骨细胞特异性分泌。LCN2通过穿越血脑屏障并以高亲和力结合下丘脑MC4R来介导其作用。在MC4R被敲除的小鼠中，LCN2的厌食作用消失。在HEK293T和GT1-7下丘脑细胞中，LCN2诱导MC4R介导的cAMP激活，而不激活ERK或酪氨酸激酶磷酸化，表明可能存在信号偏向。
7.2 Nesfatin-1
Nesfatin-1是核结合蛋白2的82个氨基酸裂解产物，是MC4R的另一种假定的内源性配体。它表达于PVN和外周组织，可减少动物的摄食和体重。研究表明，Nesfatin-1与MC4R共免疫沉淀，其HFR结构域可能与MC4R配体结合位点相互作用。删除该序列的Nesfatin-1变体在大鼠中废除了对细胞信号传导和肝葡萄糖生成的影响。
7.3 β-防御素
β-防御素是主要由上皮皮肤组织分泌的肽，可调节MC4R活性。人类β-防御素3（HBD3）在转染的HEK293细胞中能在微摩尔范围内激活cAMP和pERK1/2信号。然而，在啮齿类药理学研究中，HBD3充当黑素皮质素受体的中性拮抗剂，阻断激动剂和逆激动剂的结合。由于尚不清楚β-防御素在人或小鼠体内是否以微摩尔浓度存在，因此它们对MC4R是否有生理影响尚不明确。
8. 结论
自MC4R发现及其在食欲中关键功能的阐明以来，在理解其他蛋白和辅因子如何影响其活性方面取得了许多重要进展。这些通路和相互作用许多是最近才被发现的，对它们的进一步研究可能会在调控MC4R信号传导和运输方面产生更多见解，并可能确定新的药理学靶点。
