Cristian Canizales-Silva | Luz Helena Patiño | Jeiczon Jaimes-Dueñez | Nubia E. Matta | Juan David Ramírez
哥伦比亚罗萨里奥大学科学与工程学院微生物学与生物技术研究中心（CIMBIUR），波哥大
摘要
锥虫是一类具有鞭毛的原生动物，能够感染多种宿主。虽然锥虫属 （Trypanosoma）和利什曼原虫属 （Leishmania）因其医学重要性而受到广泛研究，但关于感染野生动物的物种的信息仍然十分有限。本研究采用综合分类学方法，对哥伦比亚两栖动物、鸟类和哺乳动物中的锥虫进行了鉴定。我们在该国托利马（Tolima）的热带干燥森林中采集了46只鸟类、18种爬行动物和两栖动物以及124只哺乳动物的样本。通过使用新型的Hsp70 （671 bp）和18S rRNA （1400–1900 bp）引物进行了检测。阳性PCR产物通过Oxford Nanopore Technologies平台进行测序，以用于系统发育分析和物种鉴定。从血液涂片中测量了形态特征，并通过PCA和PERMANOVA方法评估了表型变异。结合分子标记、物种鉴定和形态测量结果，发现了三个新物种：在野生动物中发现了Trypanosoma vallejoi 新种和Trypanosoma carranzai 新种，在两栖动物中发现了Trypanosoma guhli 新种。这一综合方法为野生动物中的锥虫诊断提供了可靠且经济高效的工具。这些发现揭示了新热带生态系统中锥虫的隐藏多样性，并展示了分子工具在连接野生动物监测与进化及分类学研究方面的价值。
章节摘录
引言
锥虫是单细胞、具有鞭毛的真核生物，其特征是拥有独特的线粒体DNA结构——动质体（Kostygov等人，2021年）。这些寄生虫具有广泛的宿主范围，可以感染植物、昆虫以及鱼类、两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳动物等多种脊椎动物（Jaskowska等人，2015年；Mendoza-Roldan等人，2022年）。历史上，由于锥虫和利什曼原虫对人类和动物的严重影响，相关研究主要集中在这两个属上。
伦理声明
所有动物的处理均遵循哥伦比亚《科学用途动物护理与使用规范》（1989年第84号法律）以及美国兽医协会（AVMA）的《动物安乐死指南》（2020年）。实验程序获得了罗萨里奥大学研究伦理委员会的批准（CEI-UR第550号法案）。野外样本的采集是在国家环境许可证机构（ANLA）颁发的许可号0011431下进行的。
研究设计
本研究
野生动物宿主的多样性及分子标记的敏感性差异
在两个研究地点共分析了188份野生动物样本。在查帕拉尔（Chaparral）地区，捕获了95个个体，包括16只鸟类、11种爬行动物和68只哺乳动物；在奥尔特加（Ortega）地区，捕获了93个个体，包括30只鸟类、7种爬行动物和56只哺乳动物。通过R v4.5.1软件（R Core Team，2025年）计算Hill指数来评估宿主多样性。如图S1所示，奥尔特加地区的鸟类物种丰富度更高，而其他分类群的多样性则在查帕拉尔地区更为显著。
分类学总结
门：Euglenozoa（Cavalier-Smith，1981年）；纲：Kinetoplastea（Honigberg，1963年）；目：Trypanosomatida（Hollande，1952年）；科：Trypanosomatidae（Doflein，1951年）；属：Trypanosoma （Gruby，1843年）。
Trypanosoma vallejoi
宿主类型： Hylophilus olivaceus
其他宿主： Pitangus sulphuratus 、Ramphocelus dimidiatus 、Sicalis flaveola 、Todirostrum cinereum 和 Thraupis palmarum
DNA序列： ORTA02样本的DNA序列已存入GenBank：18S rRNA （PX312514）、Hsp70 （PX670420）和GAPDH （PX670424）
发现地点： 哥伦比亚托利马省奥尔特加（Ortega），坐标为3°49'23.3“N, 75°20'36.0”W
分布： 分布于哥伦比亚查帕拉尔和奥尔特加地区，海拔500至1000米范围内
感染部位：
Trypanosoma carranzai
宿主类型： Myiophobus fasciatus
DNA序列： ORTA25样本的DNA序列已存入GenBank：18S rRNA （PX426277）和Hsp70 （PX670421）
发现地点： 哥伦比亚托利马省奥尔特加（Ortega），坐标为4°03'16.2“N, 75°15'55.0”W
分布： 目前仅在托利马省奥尔特加的El Triunfo村发现，海拔1000米
感染部位： 血液
备注： 血液中的锥虫呈椭圆形，平均总细胞长度为13.1 ± 0.94 μm（n = 25）。动质体较小，位于细胞特定位置
Trypanosoma guhli
宿主类型： Rhaebo haematiticus
DNA序列： CHAH9样本的DNA序列已存入GenBank：18S rRNA （PX426283）和GAPDH （PX670423）
发现地点： 哥伦比亚托利马省查帕拉尔（Chaparral），坐标为3°48'41.3“N, 75°23'16.5”W
分布： 目前仅在托利马省查帕拉尔（Chaparral）的Lemayá村发现，海拔500米
感染部位： 血液
备注： 血液中的锥虫较大且呈椭圆形，平均总细胞长度为39.45 ± 5.80 μm（n = 25）。动质体较小
讨论
历史上，新热带地区锥虫生物多样性的研究受到形态学相似性和传统分子标记系统发育分辨率的限制。本研究通过结合Oxford Nanopore Technologies的长读长测序技术、可靠的形态测量方法和统计分析，克服了这些限制。这种多维方法不仅实现了对锥虫的准确描述，还提高了研究的可靠性。
结论
本研究证实了Oxford Nanopore Technologies（ONT）测序技术在野生动物中鉴定锥虫方面的可靠性和多功能性。读长质量的提升（现已超过99%的准确性）克服了该技术的关键历史局限性。通过靶向18S rRNA 和Hsp70 基因，我们实现了稳健的系统发育分析、准确的物种分类以及共感染的检测，证明了该方法的高重复性和特异性。
未引用文献
Capistrano Costa等人，2024年；Nacional等人，2025年；Council等人，2023年。
CRediT作者贡献声明
Cristian Canizales-Silva： 文章撰写、初稿编写、数据可视化、验证、资源整理、方法设计、实验设计、数据分析、概念构建
Luz Helena Patiño： 文章撰写与编辑、项目管理、方法设计、实验设计、资金筹集
Jeiczon Jaimes-Dueñez： 文章撰写与编辑、资源管理、方法设计、实验设计
Nubia E. Matta： 文章撰写与编辑、数据可视化、验证、资源管理、方法设计、实验设计、资金筹集
致谢
我们感谢查帕拉尔（Chaparral）和奥尔特加（Ortega）社区的协助。同时，也非常感谢托利马大学（Universidad del Tolima）的所有生物学家在动物处理和样本采集方面的支持，尤其是Linda Tatiana Rubio Hernández、Weimar David Briñez Zabaleta、Nicolás David Sanabria Rivera、María José Pérez González和David Steven Díaz Vanegas。
数据可用性
本研究生成的所有序列的GenBank登录号如下： 打赏
