芳香烃降解新途径揭秘：RHA1菌株对乙酰丁香酮的共代谢转化与工程化HPEs高效利用通路构建

为解决木质素衍生芳烃化合物（HPEs）生物降解机制不清、微生物底盘催化能力有限等问题，研究人员以Rhodococcus aromaticivorans RHA1为研究对象，系统探究了其对乙酰丁香酮（AV）等HPEs的共代谢转化机制。研究鉴定出由细胞色素P450烷基愈创木酚O-去甲基酶AgcAB和烷基苯酚羟化酶AphAB介导的AV/HAP转化通路，并比较评估了三种外源Hpe通路在RHA1中的活性差异。结果表明，源自Rhodococcus rhodochrous GD02的hpe基因簇可赋予RHA1在AV和HAP上生长的能力，为构建高效微生物细胞工厂、实现木质素衍生芳烃的高值化生物转化提供了关键见解和新策略。

木质素作为植物中储量最丰富的芳香族聚合物，被视为石油基化学品的理想可再生替代原料。然而，如何高效地将木质素解聚后产生的复杂芳香化合物混合物，转化为高价值的平台化学品，是实现木质素高值化利用的关键挑战。在众多木质素衍生芳香化合物中，羟基苯乙酮（HPEs）如乙酰丁香酮、4-羟基苯乙酮和乙酰丁香酮类似物，广泛存在于氧化催化分馏和硫酸盐法制浆等工业过程产生的物流中。尽管具有重要价值，但关于HPEs微生物降解途径的认识仍非常有限，这极大地制约了利用工程微生物对其进行生物催化转化的进程。本研究发表在《Applied and Environmental Microbiology》上，旨在揭示一种极具生物催化潜力的菌株Rhodococcus aromaticivorans RHA1对HPEs的降解能力，并通过工程化改造拓展其应用潜力。

为开展本研究，作者综合运用了分子遗传学、生物化学和代谢工程学方法。关键技术包括：利用基因敲除（ΔagcA, ΔaphA等）和异源整合（通过SAGE和pRIME载体系统）构建系列RHA1突变株和工程菌株，以验证内源酶功能及比较外源通路效率。通过静息细胞转化实验测定底物消耗和产物生成。利用蛋白纯化技术获得关键酶AgcAB和AphC，并通过酶动力学分析（测定k_cat/K_M等参数）评估其底物特异性。通过高效液相色谱和液相色谱-质谱联用技术对代谢物进行定性与定量分析。通过计算机模拟对接研究酶与底物的结合模式。此外，研究还包含了不同工程菌株在HPEs上的生长表型分析。

RHA1 transforms AV and HAP

研究人员发现，虽然RHA1野生型不能在AV或HAP上生长，但其静息细胞能够将这两种底物转化为3,4-二羟基苯乙酮。通过使用ΔagcA和ΔaphA突变株进行实验，证实了细胞色素P450烷基愈创木酚O-去甲基酶AgcAB负责AV的O-去甲基化，而烷基苯酚羟化酶AphAB负责HAP的羟基化。

AgcAB catalyzes the O-demethylation of AV

体外酶学实验表明，纯化的AgcAB能够催化AV的O-去甲基化，但其对AV的表现底物特异性（k_cat/K_M约为7 mM^-1s^-1）远低于其天然偏好底物4-丙基愈创木酚（约97 mM^-1s^-1），仅为后者的约7%。

AphC catalyzes the meta-cleavage of 3,4-DHAP

研究证实，烷基邻苯二酚双加氧酶AphC能够催化AV和HAP转化产物3,4-DHAP的间位裂解。其对3,4-DHAP的比活为30 U/mg，约为其对高活性底物4-甲基邻苯二酚比活（370 U/mg）的8%。

AV induces production of catabolic enzymes in RHA1

暴露于AV能够诱导RHA1中AgcA和AphC的产生。经AV诱导的细胞，其O-去甲基化活性是无诱导剂时的约3倍，其AphC介导的间位裂解活性是琥珀酸生长细胞的230倍，但分别仅为4-乙基愈创木酚诱导水平的28%和约6%。

Comparison of three Hpe pathway variants

研究人员将来自Rhodococcus rhodochrous GD02、Sphingobium lignivorans SYK-6和Actinomadura macra的三个同源HPEs降解通路（Hpe/Acv）的前六个基因导入RHA1。比较发现，携带GD02通路的工程菌（RHAAL02）转化AV和HAP的速率最快，分别是携带SYK-6和A. macra通路菌株的43倍和97倍。而携带SYK-6通路的菌株对AS的相对活性最高，约为其对AV活性的18%。三个通路均优先转化AV和HAP而非AS。

Expression of hpeHICBADEF in RHA1 enables growth on AV and HAP

在RHA1中完整表达GD02的八个hpe基因（HpeHICBADEF）赋予了其在AV和HAP上生长的能力，获得工程菌株RHALR01。该菌株在AV上的生长速度甚至超过了野生型GD02菌株自身。然而，外源hpe基因的表达在没有AV时增加了RHA1的代谢负担，且并未提高其对高浓度AV的耐受性。

本研究系统阐明了Rhodococcus aromaticivorans RHA1通过其内源的烷基愈创木酚/烷基苯酚降解通路（涉及AgcAB, AphAB, AphC）对乙酰丁香酮和4-羟基苯乙酮的共代谢转化机制，拓展了这些关键芳香烃降解酶的已知底物谱。研究首次在RHA1这一潜力底盘菌中直接比较了三种同源HPEs降解通路的效率与底物偏好性，发现源自GD02的Hpe通路活性最高。通过代谢工程，成功构建了能够在AV和HAP上生长的RHA1工程菌株，验证了该底盘用于HPEs生物转化的可行性。这些发现深化了对细菌芳香化合物分解代谢，特别是HPEs降解的理解，为理性设计和优化用于木质素衍生芳烃高值化转化的微生物细胞工厂提供了关键的酶学知识、通路比较数据和可行的工程策略，推动了基于串联化学-生物催化路线的可持续生物制造发展。