迈向对全氟/多氟烷基物质与血清白蛋白结合的全面体外评估
1. 引言
1.1. 什么是PFAS？
全氟/多氟烷基物质（PFAS）是一类结构多样的人工合成化学品，其共同特征是分子中至少含有一个完全氟化的甲基或亚甲基基团。其中研究最广泛的是全氟烷基酸（PFAAs），这是一类具有两亲性的化合物，由氟化的疏水区域和亲水性头基构成。
碳-氟键的异常强度使得PFAS极其稳定且难以降解，导致其广泛持久地存在于环境中。因此，PFAS在全球环境与生物样本中无处不在，在美国超过98%的人体血清样本中均可检测到。除持久性和生物蓄积潜力外，全球性的PFAS污染构成了显著的健康风险。暴露于PFAS与多个器官系统的毒性相关，包括免疫、肾脏、肝脏、生殖、内分泌和神经系统。鉴于这些风险，国际癌症研究机构（IARC）在2023年将全氟辛酸（PFOA）归类为对人类致癌物（1类），并将全氟辛烷磺酸（PFOS）归类为可能对人类致癌物（2B类）。
1.2. PFAS研究的挑战
尽管PFAS已被公认为全球关注的持久性有机污染物，但大多数毒理学和暴露研究都集中在有限的PFAA同系物子集上——主要是PFOA和PFOS。这些研究为限制少数PFAS化学品生产和使用的监管行动提供了依据。然而，此类限制无意中推动了结构相关的PFAS替代品的开发，这些替代品被设计为具有更短的烷基链或醚键，以减少生物蓄积。许多这类替代品已被证明是“令人遗憾的替代品”，它们同样高度持久、被广泛使用，但其毒理学特性却鲜有表征。
问题的范围体现在美国环境保护署的PFASSTRUCTV5数据库中，该数据库目前列出了超过14,000种不同的PFAS化学结构。大多数PFAS化学品仍不受监管，关于其毒性、生物蓄积潜力或基本物理化学性质的信息有限。
由于其化学多样性和独特的物理化学性质，研究人员在表征PFAS行为时也面临重大挑战。PFAAs具有表面活性剂特性，对空气-液体和液体-液体界面有很强的亲和力，会使其亲水性头部朝向水，疏水性尾部朝向相对的另一相（空气、辛醇等）。因此，用于测定辛醇-水分配系数（KOW）的传统方法（预测有机污染物生物利用度和分布的标准参数）不适用于PFAS。尽管已探索了替代方法，但KOW并不是描述PFAS毒代动力学的合适参数，因为这些化合物优先与蛋白质结合，而不是分配到富含脂质的组织中。因此，描述蛋白质-PFAS相互作用的数据对于理解PFAS的分布和蓄积更具信息性。
1.3. PFAS与蛋白质结合
PFAS的亲蛋白质特性使其有别于亲脂性的持久性有机污染物。PFAS与蛋白质结合，并主要在富含蛋白质、血液灌注丰富的组织（如血液、肝脏和肾脏）中蓄积。研究蛋白质结合对于理解PFAS毒代动力学和生物效应至关重要，也有助于确定与PFAS结合位点的性质和结构、PFAS结合诱导的构象变化以及内源性配体的竞争性置换相关的关键分子机制。
血液循环中的蛋白质结合是决定PFAS生物蓄积和分布的基本因素。血清白蛋白是脊椎动物血液中最丰富的蛋白质，占血浆总蛋白的50%以上。它是内源性和外源性配体（包括脂肪酸、胆汁酸、维生素、激素、金属、离子、类固醇和药物）的主要载体。血清白蛋白也是许多PFAS同系物的主要血液转运蛋白，其与PFAS的结合亲和力与内源性及外源性白蛋白配体相当。白蛋白结合显著延长了许多配体（包括PFAS）的循环半衰期并延迟其消除，因此是主要的药代和毒代动力学决定因素。
虽然与蛋白质结合的PFAS部分往往在血清中存留更长时间，但游离部分则具有更高的生物利用度，易于进行组织转运，并可能表现出更高的反应性和毒性。基于生理的药代动力学（PBPK）模型研究表明，PFOA和PFOS的血浆游离部分最有可能分布到全身并进入组织和细胞。由Ng和Hungerbühler以及Cheng和Ng开发的PBPK模型强调了血清白蛋白是预测PFAA浓度和组织分布的关键参数。
鉴于PFAS巨大的结构多样性，由于成本和时间限制，对每种同系物进行传统的体内毒代动力学测试是不现实的。美国国家科学院已确定需要高通量的新方法（NAMs）来弥补这些及其他关键的化学毒性测试数据缺口和局限性。诸如PBPK和定量构效关系（QSAR）模型等计算工具在阐明PFAS毒代动力学（包括蛋白质结合对半衰期、组织分布和消除的影响）方面显示出潜力。然而，模型的准确性仍然受到实验推导的物理化学数据（特别是蛋白质结合亲和力）匮乏的限制。尽管对PFOA等已充分研究的PFAS可以准确建模，但对于大多数同系物而言，数据仍然不足。
我们实验室先前关于白蛋白-PFAS相互作用的工作发现某些PFAS不与血清白蛋白结合，这强调了在不同结构类别的PFAS中获取实证数据的必要性。基于有限同系物集建立的模型无法准确代表PFAS的全部化学多样性。缺乏全面的PFAS-蛋白质结合数据已被广泛认为是提高预测准确性的关键限制。此外，在不同已发表的研究中，显著的方法学差异导致了白蛋白-PFAS结合亲和力估计值（对于同一同系物）存在几个数量级的变化。这种可变性使数据解释复杂化，并阻碍了跨研究的比较。
2. 评估PFAS与白蛋白结合的方法
血清白蛋白与PFAS的结合是一种可逆的非共价相互作用，可发生在蛋白质的多个位点，使得白蛋白相较于传统的受体-配体模型而言是一个复杂的系统。人血清白蛋白含有七个不同的脂肪酸结合位点和两个主要的药物结合区域，称为Sudlow位点。
用于评估血清白蛋白与PFAS结合的实验技术大致可分为几类——分离法、光谱法、基于表面活性剂的方法、量热法、质谱（MS）法以及其他产生定性和定量结合数据的方法。本综述重点关注提供实验确定的结合亲和力数据，从而计算结合常数（Ka）或解离常数（Kd）的体外方法。定量白蛋白-PFAS结合的常用方法包括分离法、量热法、质谱法和光谱法。
2.1. 分离法
分离法物理分离游离和结合的配体，从而量化各部分的含量，并便于直接分析蛋白质-配体相互作用。最广泛使用的分离方法是平衡透析。该技术使用一个由半透膜分隔的双室装置，该膜不允许蛋白质通过，但允许小PFAS分子通过。
超滤离心是另一种分离方法，它使用双室装置，但应用离心力来加速液体转移。与透析相比，这减少了达到平衡所需的时间，但通常会导致PFAS非特异性吸附到膜上，降低了重现性。分析也需要质谱分析，这再次增加了成本并降低了通量。
另一种相关的分离方法，微脱盐柱技术，使用尺寸排阻色谱法分离游离PFAS与白蛋白结合复合物。在这种方法中，小的PFAS分子穿透多孔固相颗粒，并比大的白蛋白-PFAS复合物更晚洗脱出来。Han等人实现了超过98%的PFOA回收率，解决了超滤中观察到的吸附问题。然而，蛋白质回收率低和效率低下限制了此方法的实用性。总体而言，分离法简单可靠，但速度慢、劳动密集，不适合高通量PFAS筛选。
2.2. 量热法
量热法测量分子相互作用过程中的热量变化，以量化结合动力学。等温滴定量热法是最常见的量热方法，已被用于评估HSA-PFAS结合。ITC将PFAS滴定到白蛋白样品中，同时监测热量交换。它提供了全面的热力学概况，包括结合常数、化学计量、焓变、熵变、热容变化和吉布斯自由能变的估计。尽管细节丰富，但ITC通量低，需要高浓度的蛋白质，且成本昂贵，使其不适用于大规模的PFAS筛选。
2.3. 质谱法
基于质谱的方法电离混合的蛋白质-PFAS样品，并通过其质谱图检测复合物。天然质谱研究通常将电喷雾电离与质谱联用，以在保持非共价相互作用的同时将样品转移到气相。高灵敏度的ESI-MS和nanoESI-MS方法需要少量样品，并提供化学计量和亲和力数据。然而，仪器成本高昂，这限制了其可用性，并且需要专业知识来选择保持白蛋白-PFAS复合物的毛细管温度、锥孔电压和碰撞能量。此外，由于缓冲液成分对蛋白质稳定性和质谱灵敏度的影响，变异性、缺乏重现性以及同系物间灵敏度的差异也很常见。虽然功能强大，但质谱方法缺乏其他技术的简单性、可重复性和可及性。
2.4. 光谱法
光谱法监测光发射或吸收的变化（通常是荧光），以推断蛋白质-配体结合。它们是评估白蛋白-PFAS相互作用最常用的技术，包括荧光猝灭、氟核磁共振、荧光置换、微量热泳动和差示扫描荧光法分析。基于荧光的检测方法因其灵敏度、摩尔比灵活性以及高信噪比而具有优势。
荧光猝灭是一种常用的技术，通过PFAS结合时白蛋白色氨酸残基（牛血清白蛋白中的Trp134和Trp213；人血清白蛋白中的Trp214）内在荧光的减少来测量。因此，这种方法将PFAS结合引起的构象变化所导致的荧光猝灭程度与白蛋白的结构联系起来。然而，其对蛋白质构象变化的依赖性限制了其对无法引起可检测结构变化的小PFAS的适用性。短链PFAS，如PFBA、PFPeA、PFHxA和PFBS，通常表现出最小的荧光猝灭。
对于氟核磁共振波谱，量化了PFAS结合过程中氟核的共振位移，从而允许高分辨率、位点特异性评估结合化学计量和动力学。尽管功能强大，但它最适合高亲和力相互作用，需要大量的蛋白质体积，成本高，且通量低。
荧光置换测定使用与特定位点结合的探针，当被PFAS置换时，荧光会猝灭。Chen和Guo使用这种方法量化了PFAS在HSA的Sudlow位点I和II的结合，虽然能够进行位点特异性分析，但由于同时在其他白蛋白区域的结合导致复杂的荧光模式，使得解释变得复杂。微量热泳动通过测量荧光分子在温度梯度中的移动来量化结合引起的变化。MST具有高灵敏度，并且需要少量体积，但通量低且不可扩展。
在所有实验方法中，PFAS-白蛋白结合测量对温度、pH、缓冲液成分以及蛋白质和配体浓度的实验差异都很敏感。因此，根据实验方法和条件的不同，不同研究报告的亲和力可能相差几个数量级。当在相同的实验条件下得出时，定量值作为相对亲和力解释才最有意义。虽然所有这些方法都推进了人们对PFAS-白蛋白相互作用的理解，但该领域仍然缺乏高通量、可直接比较的定量数据。
3. 差示扫描荧光法
3.1. DSF的原理和用途
天然蛋白质的折叠状态是一个热力学驱动的过程，蛋白质稳定性与系统的吉布斯自由能变直接相关，后者受温度等环境因素的影响。随着温度升高，蛋白质稳定性降低，导致变性，相应的吉布斯自由能增加。蛋白质熔解温度定义为达到平衡时的温度，此时50%的蛋白质保持折叠状态，50%变性。
差示扫描荧光法在20世纪90年代被引入，作为一种初步的药物发现筛选方法，用于识别与特定靶蛋白相互作用的生物活性分子。DSF的核心原理是，特异性和非特异性结合相互作用都可以改变蛋白质稳定性。尽管存在重要的例外情况，但蛋白质-配体复合物的形成通常会降低吉布斯自由能变，与配体结合的吉布斯自由能变成正比，导致蛋白质热稳定性增加，表现为熔解温度的变化。在受控条件下，DSF通过量化不同配体浓度下蛋白质熔解温度的变化来直接测量这些稳定性变化。m定义为50%蛋白质展开时的温度，(3) 所有蛋白质完全变性，(4) 高温下由于蛋白质聚集导致荧光降低。(B) 图表描绘了从60°C到85°C的典型DSF荧光曲线，表示为标准化为最大荧光百分比的RFU数据，其中天然蛋白为黑色，配体结合蛋白为粉色。ΔTm通过从配体结合蛋白的Tm中减去天然蛋白的Tm来计算。">
在DSF测定中，通过测量内在或外在荧光来监测蛋白质在指定温度范围内的热变性。对于基于内在荧光的DSF，追踪蛋白质自身发出的荧光，以评估与配体结合等环境变化相关的信号变化。在基于外在荧光的DSF中，一种荧光环境传感染料被整合到测定介质中。这些染料在溶液中游离时通常被猝灭，但随着蛋白质展开，荧光会增加。虽然不适合两亲性PFAS，但SYPRO Orange是一种常用的环境传感荧光染料，具有高信噪比，能够结合在蛋白质热变性过程中暴露的疏水残基。
3.2. 用于测量白蛋白-PFAS结合的DSF
差示扫描荧光法代表了一种相对新颖的测量血清白蛋白与PFAS结合的方法，在快速、大规模表征不同结构PFAS方面具有显著优势。然而，DSF中常用的荧光染料——SYPRO Orange——与含有表面活性剂或洗涤剂的测定体系不兼容。由于许多PFAS因其两亲性结构而表现出表面活性剂特性，因此不能使用SYPRO Orange来评估白蛋白-PFAS相互作用。此外，血清白蛋白的多个疏水结合位点会与这种疏水性染料结合，导致不可接受的高背景荧光。因此，基于DSF的白蛋白-PFAS结合测量需要替代的荧光检测策略。
两种已被证实在白蛋白-PFAS结合测定中兼容的合适替代方法是内在色氨酸荧光和环境敏感的分子转子染料。Alesio和Bothun使用一种无标记的内在荧光DSF方法来测量BSA-PFAS结合。该方法依赖于PFAS诱导的白蛋白构象变化，该变化猝灭了色氨酸残基的内在荧光，并且能够量化白蛋白对所有测试PFAS的亲和力。无标记设计的优势包括减少了试剂需求，并消除了任何来自外源染料的潜在结合干扰。然而，这种方法可能与其他基于荧光猝灭的技术有相同的局限性，即某些PFAS（包括短链和超短链PFAS，如三氟乙酸）不能诱导足够的构象变化来产生可检测的猝灭。
环境敏感的荧光分子转子染料提供了第二种与DSF兼容的替代方案。当环境条件（如局部粘度）的变化限制了荧光团分子的分子内旋转时，这些染料会发出荧光。几种分子转子染料，包括基于久洛里定的染料和4-(4-(二甲氨基)苯乙烯基)-N-甲基吡啶碘化物，已被验证可用于DSF测定中测量白蛋白-PFAS相互作用。分子转子染料由三个关键部分组成：一个电子给体、一个电子受体和一个分隔给体与受体的可旋转间隔基。
在基线状态下，由于电子受体和给体围绕中心间隔基的分子内旋转，分子转子染料表现出低荧光输出。当周围微环境的粘度增加时，这种旋转受到限制，导致荧光发射量增加。研究表明，白蛋白-PFAS结合会产生足够的环境粘度变化，从而在空间上限制分子转子染料，并在DSF测定过程中产生可测量的荧光增加。
差示扫描荧光法代表了一种相对新颖的方法，在大规模和快速表征蛋白质与PFAS（特别是血清白蛋白-PFAS）的结合方面具有显著优势。与此处描述的其他方法相比，DSF快速、易得、稳健且可重复。此处描述的许多其他蛋白质-配体结合方法耗时、劳动密集且不易获得，而标准的DSF实验通常只需一到三个小时，使用普遍可用的仪器，并且可以在同一天完成直接的数据分析。此外，它在评估任何可溶性蛋白质和配体组合的结合方面具有灵活性。
在测定过程中，样品在实时聚合酶链式反应（PCR）热循环仪中加热，随着温度升高，蛋白质天然结构丧失导致染料/蛋白质相互作用的微环境改变，荧光强度增加。在某些情况下，变性蛋白质在更高温度下会发生聚集，导致荧光输出降低。该测定通常以96或384孔板形式进行，允许同时分析多个实验条件。该测定不仅通量高，而且能够以高容量形式进行每次运行，从而可以在单次运行中同时测量多种对照和实验配体及浓度下的蛋白质熔解。这种兼容性使DSF非常适合高通量筛选。该方法的可及性是另一个主要优势，因为DSF测定使用广泛可用且相对便宜的实时PCR仪器。此外，DSF需要相对较少的蛋白质体积，成本相对较低，并且可及于全球南方及其他中低收入国家的实验室。
除了有助于高通量筛选的可及性和快速测定时间外，DSF还是蛋白质-配体结合分析的稳健可靠方法，特别适用于检测低亲和力相互作用。与一些传统方法不同，DSF非常合适。其他方法学未能量化甚至检测到血清白蛋白与低分子量PFAS同系物之间的结合；相比之下，DSF可可靠地检测和量化短链和超短链PFAS（如PFBA和三氟乙酸）的结合。
除了确定结合亲和力外，DSF还为蛋白质-配体相互作用的热力学性质提供了有价值的见解。在白蛋白-PFAS结合过程中观察到的蛋白质熔解温度变化提供了关于配体稳定或去稳定效应的信息。尽管大多数蛋白质-配体相互作用稳定蛋白质，但一些PFAS会产生去稳定相互作用，相对于天然蛋白质降低了熔解温度。识别具有去稳定相互作用的PFAS同系物（由负的ΔTm值表示）可能为PFAS诱导的蛋白质破坏机制提供线索，并指导进一步的机理研究。
ΔTm的大小也具有信息性。ΔTm反映了配体诱导的熔解温度变化，源于控制蛋白质-配体相互作用的焓和熵因素的综合。白蛋白与许多PFAS的结合主要由非共价的疏水、静电和范德华力驱动，大的ΔTm变化是熵驱动的疏水相互作用的特征。因此，在与解离常数一起解释时，考虑ΔTm有助于更全面地理解结合的热力学。然而，必须谨慎解释ΔTm。因为ΔTm由焓贡献和熵贡献共同决定，它并不与结合亲和力直接相关。
3.3. DSF的局限性
与所有方法学方法一样，差示扫描荧光法也存在局限性，在设计、进行和解释结合实验的结果时必须加以考虑。一个关键要求是配体必须在缓冲的生理水溶液中有足够的溶解度——该溶液只能包含极低浓度的化学溶剂，如甲醇或DMSO——并且必须经过验证和适当控制，以确保溶剂的添加不会破坏蛋白质结构。因此，用于PFAS分析的DSF与其他白蛋白-PFAS结合方法有一个共同的局限性：许多PFAS同系物，特别是长链PFAAs（C12及以上）水溶性差，阻碍了在测定中准确测量其结合。因此，DSF测量仅限于具有足够溶解度的PFAS同系物。此外，尽管初步分析表明PFAS不会干扰测定，但发出内在荧光的PFAS同系物如果其荧光与报告染料的荧光重叠，则可能不兼容。另外，必须确认环境传感染料的化学性质不会人为地改变蛋白质/PFAS的相互作用。这些潜在问题很容易解决，但需要针对每种感兴趣的蛋白质仔细优化测定，并在每次重复实验测定中包含所有必要的对照。
正如在更广泛的HSA-PFAS结合讨论中提到的，直接比较不同实验设计之间的绝对结合亲和力可能具有挑战性，必须避免。这个问题对于DSF尤其相关，因为DSF是从蛋白质熔解的温度依赖性变化推导亲和力估计值，而不是在恒定温度下测量得到。因此，DSF推导的亲和力值——尽管
