作者：梅赛德斯·格里马-特伦（Mercedes Grima-Terrén）、梅根·罗梅尔芬格（Megan Rommelfanger）、西尔维娅·坎帕纳里奥（Silvia Campanario）、安德烈斯·西斯内罗斯（Andrés Cisneros）、艾娜·卡尔斯（Aina Calls）、伊格纳西奥·拉米雷斯-帕尔多（Ignacio Ramírez-Pardo）、琼·伊塞尔恩（Joan Isern）、安东尼奥·L·塞拉诺（Antonio L. Serrano）、欧塞比奥·佩尔迪格罗（Eusebio Perdiguero）、普拉·穆尼奥斯-卡诺维斯（Pura Muñoz-Cánoves）
所属机构：Altos Labs，圣地亚哥科学研究所（San Diego Institute of Science），美国加利福尼亚州圣地亚哥市92121
摘要 肌肉萎缩和功能衰退是衰老及神经肌肉疾病共同的临床表现。由于在分子层面对肌肉纤维（骨骼肌中最丰富的细胞类型）进行表征存在困难，因此揭示这些情况下肌肉衰退的分子机制进展缓慢。与无法区分多核细胞的单细胞RNA测序（scRNA-seq）相比，单核RNA测序（snRNA-seq）能够从难以分离的固体组织中分离出单个细胞核，从而为研究骨骼肌提供了重要优势。本文详细介绍了从骨骼肌中正确分离细胞核并用于后续转录组分析的方案。此外，我们还概述了适用于骨骼肌snRNA-seq数据的基本生物信息学流程，重点关注稳态肌肉状态与萎缩肌肉状态之间的转录组差异。
引言 肌肉骨骼系统由骨骼、韧带、软骨、结缔组织和肌肉组成，它提供力量、维持姿势并实现运动。骨骼肌约占哺乳动物体重的40%，是人体中最大的组织之一，也是最具可塑性的组织之一。在稳态条件下，肌肉结构高度有序，主要由纵向排列的多核细胞（肌纤维）以及支持肌纤维功能的各种单核细胞（如血管细胞、免疫细胞、基质细胞和肌肉干细胞）构成。 在急性损伤、疾病或衰老等病理生理状态下，骨骼肌的转录组变化已通过啮齿动物（Kang等人，2022年；Lin等人，2018年；Shavlakadze等人，2023年；Shavlakadze等人，2019年）和人类（Tumasian等人，2021年；Zahn等人，2006年）的研究得到了广泛研究。过去十年中，单细胞技术的出现极大地加深了我们对健康和疾病状态下肌肉组织复杂性的理解。早期使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）的研究对肌肉中的单核细胞群体进行了深入的转录组分析（Dell’Orso等人，2019年；Giordani等人，2019年；Oprescu等人，2020年；Micheli等人，2020年；Rubenstein等人，2020年）。然而，获取单细胞悬浮液所需的组织消化过程会导致细胞分离压力（尤其是在肌肉干细胞中尤为明显，Machado等人，2017年），进而造成肌纤维的破坏和丢失。
最近，单核RNA测序（snRNA-seq）技术的应用使得能够在接近自然状态的情况下，对肌肉细胞群体中的所有类型细胞核进行转录组分析，包括发育过程（Petrany等人，2020年；Santos等人，2020年）、再生过程（Kim等人，2020年）、萎缩过程（Calvo等人，2025年；Ham等人，2025年；Lin等人，2022年），以及小鼠（Petrany等人，2020年）和人类（Kedlian等人，2024年；Lai等人，2024年）的衰老过程。这些开创性研究揭示了某些特化肌核亚群的转录特征，例如肌腱连接处（MTJ）和神经肌肉接头（NMJ）的细胞核，为后续研究提供了便利。
肌肉的可塑性使其能够适应不同的生长需求或萎缩压力。肌肉萎缩常见于多种情况，包括长期不活动及多种神经肌肉疾病中，通常与渐进性衰老相关；在所有情况下，萎缩表现为蛋白质和细胞器的净丢失，导致肌纤维体积缩小和肌肉质量减少。本文提供了一种优化且可重复的方案，用于从快速冷冻的骨骼肌中分离细胞核，以便进行后续的转录组分析，并便于比较不同生理状态下的变化。通过使用坐骨神经切断模型来诱导因轴突接触丧失而导致的肌肉萎缩，我们证明了该方法适用于研究稳态肌肉和萎缩肌肉组织中不同细胞类型的转录变化。该工作流程还包括详细的生物信息学处理和分析指南，确保数据质量和实验条件的一致性。
实验细节 实验动物 实验所用C57BL/6J小鼠（野生型）来自Charles River Breeding Laboratories或西班牙国家心血管研究中心（CNIC）的自体繁殖群体。小鼠被饲养在标准笼子中，遵循12小时光照-黑暗周期，并可自由摄取标准饲料。所有动物实验和程序均获得了CNIC机构及区域动物研究委员会的批准。实验对象为3至4个月大的年轻成年小鼠。
结论 本文描述的标准化方案是一种高效且可重复的方法，可用于从静息状态和萎缩（去神经化）的鼠骨骼肌组织中分离细胞核。该方法适用于样本量有限的情况，尤其适用于处理快速冷冻组织，便于灵活的样本处理和长期存储，从而支持多种实验设计。
作者贡献声明 琼·伊塞尔恩（Joan Isern）： 撰写、审稿与编辑、监督工作。
安东尼奥·L·塞拉诺（Antonio L. Serrano）： 监督、概念设计。
艾娜·卡尔斯（Aina Calls）： 验证、实验研究。
伊格纳西奥·拉米雷斯-帕尔多（Ignacio Ramírez-Pardo）： 验证、数据分析。
安德烈斯·西斯内罗斯（Andrés Cisneros）： 验证、数据分析。
梅根·罗梅尔芬格（Megan Rommelfanger）： 撰写、初稿撰写、软件开发、方法学设计、数据分析。
西尔维娅·坎帕纳里奥（Silvia Campanario）： 方法学设计、实验研究。
普拉·穆尼奥斯-卡诺维斯（Pura Muñoz-Cánoves）： 撰写、审稿与编辑、概念设计。
梅赛德斯·格里马-特伦（Mercedes Grima-Terrén）： 撰写、初稿撰写。
致谢 我们感谢Altos Labs的所有团队成员在技术支持和富有洞察力的讨论中所做的贡献。PMC实验室的工作部分得到了ERC-2016-AdG-741966项目和MINECO-Spain（RTI2018-096068项目）的支持（该项目资助了UPF的Maria de Maeztu卓越单位计划（MDM-2014-0370）；M.G.T.、I.R.P.和A.C.分别获得了FI、FPU、FPI的资助以及Maria de Maeztu博士前奖学金的支持；同时，他们还得到了Altos Labs Inc.的资助。
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