RIG-I佐剂化双顺反子免疫原通过激发T细胞免疫控制克氏锥虫感染、南美锥虫病性心肌病及左心室功能障碍

为解决成人南美锥虫病(Chagas disease, CD)缺乏有效预防与治疗手段的临床难题，研究人员设计了符合FDA指南的、包含TcG2与TcG4抗原的双顺反子免疫原BCV及添加RIG-I佐剂的BCVR。在小鼠模型中发现，这两种免疫原安全有效，不仅能显著降低急、慢性感染期的组织寄生虫负荷，控制心肌炎与纤维化，还能保护左心室功能，防止心衰，为开发成人CD免疫疗法提供了新的希望。

在美洲，从美国南部到阿根廷的广阔地域，潜伏着一种名为克氏锥虫(Trypanosoma cruzi, Tc)的寄生虫。它通过锥蝽叮咬等途径传播，是南美锥虫病(Chagas disease, CD)的元凶。这种疾病堪称“沉默的杀手”，初期感染症状轻微或不明显，但高达10%-40%的感染者会在数年至数十年后，发展为严重的心肌病、心力衰竭甚至猝死。据估计，2023年该病造成了30.8万至39.8万新发病例，每年导致约1.2万人死亡，造成的年经济负担超过100亿美元。更严峻的是，目前仅有的两种特效药苄硝唑和硝呋莫司，虽然对儿童有效，但因治疗失败、毒副作用以及对许多临床分离株耐药等问题，不推荐用于成年患者和孕妇。这意味着，对于前往流行区的成年旅行者，没有预防感染的手段；对于已感染的成年人，也没有能够彻底清除寄生虫、阻断疾病发展的疗法。因此，开发一种安全有效、能够预防成人感染或治疗已感染成人的疗法，已成为一项紧迫的全球公共卫生需求。近日，一项发表于《JACC: Basic to Translational Science》的研究带来了突破性进展。该研究团队成功设计了一种新型双顺反子DNA免疫原，在动物模型中证实其能高效激发保护性T细胞免疫，不仅控制寄生虫感染，更能有效阻止南美锥虫病典型的心肌损伤和心功能恶化，为攻克这一难题点亮了新曙光。

为验证新型免疫原的效果，研究人员开展了一系列严谨的实验。他们采用了生物信息学筛选结合生物学验证的方法，从克氏锥虫基因组中筛选出高保守且免疫原性强的抗原TcG2和TcG4。随后，他们构建了小鼠密码子优化的TcG2-TcG4双顺反子序列，并克隆到符合美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)指南的纳米质粒中，制备了基础免疫原BCV，以及添加了RIG-I激动剂佐剂的增强版免疫原BCVR。研究使用C57BL/6雌性小鼠建立急性和慢性南美锥虫病模型，通过肌肉注射给予不同剂量的BCV或BCVR进行免疫，随后用克氏锥虫SylvioX10株进行攻击感染。通过定量聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)检测组织寄生虫负荷，组织切片染色（苏木精-伊红染色，Masson三色染色）评估炎症浸润和纤维化，流式细胞术详细分析脾脏T细胞亚群的表型与功能，酶联免疫吸附测定检测血清中抗寄生虫抗体水平及其功能（凝集、溶虫实验），并利用超声心动图全面评估慢性感染期小鼠的心脏结构和左心室功能。

免疫原、CD模型和研究设计

研究人员通过计算与生物学筛选，选择了在所有寄生虫谱系中保守、并被多宿主感染后特异性1型CD8⁺T细胞识别的抗原。最终选用免疫原性优异的TcG2和TcG4，将其小鼠密码子优化序列通过P2A连接子串联，克隆至不含/含有RIG-I佐剂的纳米质粒，分别构建了BCV和BCVR。利用C57BL/6小鼠感染克氏锥虫SylvioX10株的模型，该模型可模拟人类CD的急性寄生虫血症、不确定期和慢性心肌病期，用以系统评估免疫原的安全性与短期、长期效力。

评估BCV和BCVR的安全性

研究遵循世界卫生组织指南评估了免疫原的局部反应原性和全身毒性。结果显示，BCV和BCVR免疫的小鼠仅在注射后第一周活动略有变化，但摄食、饮水和体重无影响，局部反应轻微短暂。血液学、临床生化和血液涂片分析表明，免疫原未引起显著的血液学异常或急性器官损伤指标变化。尽管检测到针对心脏可溶性抗原的IgG有轻微升高，但在感染或未感染状态下，免疫组与未免疫组之间无显著差异，表明免疫原安全，未引发显著的局部或全身毒性。

确定控制Tc感染的免疫原剂量

通过剂量滴定实验，发现10 μg剂量的BCV和BCVR在控制急性期心脏和骨骼肌组织寄生虫负荷方面效果最佳，分别降低了83%-92%和37%-80%。长期（100天后）攻击感染，控制效果依然显著。组织学分析进一步证实，免疫显著减少了急性感染期心脏和骨骼肌中的炎症浸润。综合表明，10 μg剂量可最大程度控制寄生虫复制和相关炎症病理，且BCVR的短期和长期效果略优于BCV。

BCV和BCVR改善了Tc特异性T细胞的成熟和功能

流式细胞术分析显示，与单纯感染组相比，BCV.Tc和BCVR.Tc组小鼠的脾脏中，成熟的CD4⁺和CD8⁺效应T细胞晚期表型(Teff-L)及效应记忆T细胞晚期表型(Tem-L)亚群频率进一步增加。其中，BCVR.Tc组的CD4⁺Teff-L亚群是细胞毒性分子（如颗粒酶B、穿孔素）和肿瘤坏死因子α产生的主要来源，利于杀灭寄生虫；而CD8⁺T细胞则表现为功能激活但产生较少的细胞毒性/炎症分子，利于限制组织损伤。此外，IL-17A⁺细胞（包括部分先天性淋巴细胞样细胞）也有所增加。这表明免疫原促进了初始T细胞向可长期存在的成熟效应和记忆亚群分化，并引导了更平衡、有效的免疫应答。

BCV和BCVR诱导了功能性抗寄生虫抗体应答

免疫后，小鼠血清中抗Tc的总IgG、IgG1和IgG2a水平显著升高，且BCVR诱导的抗体水平高于BCV。感染后，所有组抗体水平均大幅上升，但免疫组的IgG2a/IgG1比率（保护性指标）在急慢性感染期均更高。功能实验表明，免疫后血清在体外能有效凝集并溶解锥鞭毛体。这说明BCV/BCVR增强了抗体向保护性IgG2a亚型的转换，所产生的抗体具有抑制寄生虫运动和存活的功能。

慢性南美锥虫病中的心肌病和左心室功能障碍（±BCV或BCVR）

在慢性感染期，单纯感染组小鼠心脏和骨骼肌中仍有显著寄生虫持续、严重的炎症浸润和广泛的胶原沉积（纤维化）。而BCV.Tc和BCVR.Tc组则显著降低了组织寄生虫负荷（心脏降低54%-99.5%），将融合性炎症浸润转为弥漫性，并完全控制了心脏纤维化，大幅减少了骨骼肌纤维化。超声心动图显示，慢性CD小鼠出现左心室肥厚、后壁变薄、收缩和舒张功能严重受损（如射血分数、心输出量下降）。相比之下，BCV.Tc和BCVR.Tc组小鼠的左心室质量、后壁厚度基本维持正常，心脏收缩和舒张功能得到部分至完全恢复，以BCVR.Tc组效果最佳。这表明免疫原通过控制胶原沉积和心脏僵硬，保护了左心室血流动力学和心肌功能。

结论与讨论

本研究表明，使用双顺反子免疫原控制克氏锥虫感染及其导致心衰的相关病理是一个可实现的目标。BCV和BCVR设计简单、递送方便，为成人预防和控制感染提供了低成本、安全的选择，弥补了现有化疗药物的不足。该研究首次证明了一种无毒性双顺反子免疫原能在CD模型中有效控制克氏锥虫相关病理并保护心脏功能。其机制在于，免疫原促进了保护性、长效的T细胞免疫（特别是成熟的CD4⁺和CD8⁺效应与记忆T细胞）和功能性抗体应答，从而在急性期高效清除寄生虫，在慢性期控制低度寄生虫持续、抑制有害炎症和纤维化，最终维持心脏结构与功能。值得注意的是，免疫带来的益处并非通过持续刺激病理性/炎症性T细胞实现，而是在清除寄生虫后，免疫系统恢复了更平衡的状态。由于TcG2/TcG4抗原在不同克氏锥虫谱系中高度保守，研究人员预期BCV/BCVR将对流行区循环的多种分离株提供广谱免疫力。尽管本研究未涉及性别差异及孕期安全性，但其结果为后续在远交系动物或自然感染动物模型中验证免疫原性，并最终推动该免疫疗法用于人类，铺平了道路。这项研究为应对南美锥虫病这一被忽视的公共卫生紧急事件，提供了极具转化前景的新策略。