癌症治疗领域，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法已成为对抗血液恶性肿瘤的一柄利器。然而，这把“利剑”的锻造过程——即CAR-T细胞的制造——却存在诸多挑战。目前获批的疗法均依赖于病毒载体（如慢病毒、逆转录病毒）将CAR基因稳定整合到T细胞基因组中。这种方法虽然能实现长期的CAR表达，但也带来了包装容量有限、转导效率不一、制造成本高昂以及难以规模化生产等一系列“卡脖子”难题，无形中抬高了这种个性化治疗的门槛。为了破解这些难题，科学家们将目光投向了非病毒递送策略。其中，脂质纳米粒(LNP)作为一种可规模化、成本效益高的核酸递送平台，在COVID-19 mRNA疫苗中已大放异彩，它同样被视为改造T细胞的潜力新星。不过，T细胞是出了名的“难转染”细胞。过往研究多聚焦于电荷中性的LNP配方，其转染效率往往受限于特定的细胞培养条件。那么，LNP的表面电荷这一关键属性，是否会成为解锁T细胞高效转染的新密码？培养基中的特定蛋白又是否会与LNP“携手”，影响T细胞的“吞噬”与改造？为了回答这些问题，一个研究团队在《Advanced Science》上发表了他们的最新发现。
为探究LNP电荷和培养基成分对T细胞工程的影响，研究者运用了多项关键技术。他们从人类供者的外周血单核细胞(PBMC)中分离出原代CD3+T细胞，并使用抗CD3/CD28/CD2抗体和白细胞介素-2(IL-2)进行活化培养。研究核心是采用微流控技术制备了两种LNP：一种是基于可电离脂质C12-200的电荷中性LNP，另一种是额外掺入永久带正电的阳离子脂质DOTAP的C12-200 LNP，两者均包裹编码报告基因（增强型绿色荧光蛋白eGFP、荧光素酶Luc）或抗CD20纳米CAR的mRNA。通过马尔文粒度仪对LNP的粒径、多分散指数(PDI)和Zeta电位进行了表征。转染实验在多种培养基（含血清、无血清、添加载脂蛋白E(ApoE)或转铁蛋白的化学成分确定培养基）中进行。转染效率、LNP与细胞相互作用通过流式细胞术进行定量分析，并用共聚焦显微镜进行可视化观察。细胞活力通过CellTiter-Glo发光法检测。最后，通过体外共培养杀伤实验，评估了由LNP工程化产生的抗CD20纳米CAR-T细胞对CD20+Raji淋巴瘤细胞的杀伤效力。
LNP电荷和细胞培养介质组成影响Jurkat细胞的转染效率
研究者首先在Jurkat细胞（一种永生化T细胞系）中进行筛选。他们发现，在无血清培养基中，C12-200 LNP的转染效率显著优于含血清条件。而掺入DOTAP形成阳离子LNP后，其在无血清培养基中的转染效率（~78%）远超电荷中性C12-200 LNP（~33%）。但在含血清培养基中，两种LNP的转染效率均极低，提示血清蛋白可能屏蔽了阳离子LNP的表面电荷。进一步在化学成分确定的无血清培养基中添加特定蛋白的实验表明，阳离子DOTAP(C12-200) LNP的转染完全不依赖于培养基中添加的ApoE或转铁蛋白；相反，电荷中性的C12-200 LNP只有在培养基中添加了ApoE蛋白时，转染效率才得到显著提升，同时细胞结合也更强。这表明两者的转染机制可能存在根本差异。
阳离子LNP无论介质或活化状态如何均能实现对原代T细胞的稳健转染
关键结论在从人血液分离的原代T细胞中得到了验证。T细胞在活化后，会随时间推移上调CD25、CD71（转铁蛋白受体）和低密度脂蛋白受体(LDL-R)等活化标志物的表达。实验在活化后第3、6、10天进行转染。结果再次确认：DOTAP(C12-200) LNP能够不依赖于培养基成分（无论是否添加ApoE）和T细胞的活化时间点，实现稳定且高效的mRNA递送。而C12-200 LNP的转染则严格依赖于ApoE的存在，并且在活化后第6天效果最佳。尽管阳离子LNP能诱导更高的mRNA表达水平（每个细胞的荧光强度更高），但其细胞毒性也相对更大，导致活细胞产率有时不及在最优条件下（添加ApoE）的C12-200 LNP。共聚焦成像显示，阳离子LNP与细胞膜有强烈的相互作用，可能通过静电作用吸附，而C12-200 LNP与细胞的结合则因ApoE的存在而增强。
增加无毒的C12-200 LNP剂量可提高T细胞转染产率
鉴于C12-200 LNP细胞毒性低，研究者进行了mRNA剂量滴定。他们将mRNA剂量从0.5 ng/µL提高至3 ng/µL，发现在无血清培养基中，即使不添加ApoE，高剂量的C12-200 LNP也能实现高达约55%的转染效率，且细胞活力仍保持在85%左右，最终获得了约60%的活细胞转染产率。这表明，通过提高剂量，可以在一定程度上克服对ApoE的依赖，为工艺简化提供了另一种可能。
ApoE蛋白的存在影响mRNA表达动力学
研究人员追踪了C12-200 LNP递送的mRNA在T细胞中的表达持续时间。发现eGFP表达在转染后96小时内仍可检测，但强度和阳性细胞比例从48小时后开始显著下降。重要的是，培养基中添加ApoE不仅能提升初始的转染效率和表达水平，还能使较高的表达水平维持更长时间。流式和成像数据均证实ApoE增强了LNP与细胞的结合。此外，分析显示只有处于高度活化状态（高前向散射FSChigh）的T细胞才能被C12-200 LNP有效转染，突出了T细胞活化状态的关键作用。
可电离和阳离子LNP均可有效在活化T细胞中递送纳米CAR mRNA
研究从模型mRNA转向治疗性mRNA。他们使用两种LNP向活化T细胞递送编码抗CD20纳米CAR的mRNA。纳米CAR使用源自骆驼科动物的纳米抗体作为抗原结合域，具有分子小、免疫原性低等潜在优势。结果表明，两种LNP均能成功在T细胞表面表达功能性纳米CAR。对于C12-200 LNP，添加ApoE能将显著的纳米CAR表达从24小时延长至48小时。而DOTAP(C12-200) LNP在1 ng/µL的较低剂量下，就能在T细胞上诱导出比C12-200 LNP（3 ng/µL）更高的纳米CAR表达密度（中位荧光强度更高），再次彰显了其高效递送能力。
瞬时工程化的纳米CAR-T细胞具有肿瘤细胞杀伤能力
功能的终极检验是杀伤实验。将LNP工程化产生的抗CD20纳米CAR-T细胞与CD20+Raji淋巴瘤细胞共培养。结果显示，无论是C12-200还是DOTAP(C12-200) LNP产生的纳米CAR-T细胞，都能特异性杀伤靶细胞，最高在20:1的效靶比下实现了约40%的特异性杀伤。虽然添加ApoE对C12-200 LNP组的纳米CAR表达有延长作用，但在此杀伤实验体系中，并未显著转化为更强的杀伤效力。分析发现，在特定效靶比下，转染效率（即纳米CAR-T细胞的比例）与特异性杀伤效力呈正相关，强调了高效转染的重要性。
在讨论与结论部分，研究者深入阐释了其发现的意义。他们提出，阳离子DOTAP(C12-200) LNP很可能通过其正电荷与带负电的细胞膜发生非特异性静电相互作用，或通过巨胞饮等途径进入细胞，这是一种不依赖于特定受体介导的“被动”靶向机制。这解释了为何其转染不受培养基中添加蛋白（ApoE pI~5.6， 转铁蛋白 pI~6.7）的影响，且在T细胞活化后期仍能有效工作。相反，电荷中性的C12-200 LNP则可能依赖于ApoE吸附到其表面，进而通过T细胞活化后上调的LDL-R进行受体介导的内吞，这是一种“主动”靶向过程。这要求T细胞必须处于适当的活化状态，且培养基中需存在特定蛋白。
这种机制上的分野带来了不同的应用前景。阳离子LNP的核心优势在于其“鲁棒性”：它简化了生产工艺，减少了对复杂培养基成分（如特定重组蛋白）的依赖，并放宽了对T细胞活化时间窗口的严格要求。这使得利用活化程度较低的T细胞亚群进行更快速、低成本的制造成为可能，有助于减少T细胞耗竭，缩短“从静脉到静脉”的治疗时间。而电荷中性LNP在优化条件下（添加ApoE，特定活化时间点）则能提供更高的活细胞转染产率和更好的生物相容性，尤其在需要更高剂量时显示出优势。
本研究成功证明，利用这两种LNP均可实现基于mRNA的瞬时纳米CAR-T细胞工程化，并产生具有肿瘤杀伤功能的细胞产品。这为替代当前病毒载体的CAR-T制造提供了一条具有吸引力的非病毒路径。尽管瞬时表达在持久性上面临挑战，但这本身也能降低长期毒性风险，并允许通过多次给药来维持疗效。未来，通过结合自扩增mRNA、环状RNA等技术延长表达时间，将进一步推动此类疗法走向临床。总之，这项研究系统揭示了LNP电荷这一关键设计参数在离体T细胞工程中的核心作用，为下一代低成本、可扩展的CAR-T细胞制造工艺的开发奠定了重要的科学基础。
