在21世纪，合成生物学的飞速发展有赖于DNA合成这一基础技术的支撑。然而，主流的化学合成方法（亚磷酰胺法）存在诸多瓶颈，例如合成的DNA链长度受限（通常小于300个核苷酸），需要使用有毒试剂并产生有害废弃物，且逐步掺入效率不高。这些问题严重制约了长链DNA的合成，影响了基因编辑、DNA数据存储等一系列前沿生物技术的实际应用。为了寻求突破，基于酶的DNA合成技术应运而生，它被视为一种更绿色、更高效、有望实现千碱基（kb）级DNA合成的理想替代方案。其中，末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT）因其无需模板即可在单链DNA的3′端连续添加脱氧核苷酸的能力，成为酶法DNA合成的核心引擎。然而，天然TdT对用于控制合成的可逆终止子核苷酸（如3′–ONH2 –dNTPs）催化效率低下，成为其走向工业应用的关键障碍。为此，研究人员展开了一项旨在“重铸DNA合成之钥”的TdT蛋白质工程研究。
该研究论文《Semi-rational engineering of terminal deoxynucleotidyl transferase for high-efficiency enzymatic de novo DNA synthesis》发表在《Synthetic and Systems Biotechnology》期刊上。研究团队通过一系列精巧的实验设计，最终打造出了一个性能卓越的TdT“超级工具”，为解决酶法DNA合成的效率问题提供了创新方案。
为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，通过生物信息学从UniProt数据库挖掘了226个TdT同源序列构建系统进化树，并筛选了11个代表性TdT进行异源表达和酶活比较。其次，利用AlphaFold3（AF3）等计算工具对靶酶（牛源TdT, BtTdT）进行三维结构建模，指导了关键的N端结构域截短、定点诱变和半理性饱和突变设计。关键的酶活性评估，依赖于基于荧光染料SYBR Gold染色和灰度值计算（ImageJ软件）的准确活性测定方法。最后，为验证优化后TdT的从头合成能力，建立了基于链霉亲和素磁珠的循环合成体系，实现了10-nt单链DNA的逐步合成，并用质谱对产物进行了验证。
3.1. 系统进化树分析与TdT筛选
研究人员从生物信息学分析入手，从UniProt数据库中筛选了226个TdT序列构建了系统发育树，以探究TdT在不同脊椎动物类群中的进化关系。为进行平行比较，他们挑选了11个与目标酶（牛源TdT, BtTdT）序列同一性在40.9%至98.8%之间的代表性TdT进行体外酶活测试。在优化的表达和纯化条件下，成功获得了9个可溶性重组蛋白。通过DNA尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳结合荧光染料染色和灰度值定量分析，研究人员发现，在测试的TdT中，BtTdT对天然dNTP底物以及非天然底物（如3′-ONH2 –dNTP）均展现出最高的催化活性，因此被选为后续酶学性质表征和蛋白质工程的起始模板。
3.2. BtTdT的催化特性
接下来，研究人员对BtTdT的酶学性质进行了全面表征。他们系统评估了该酶的最适pH、温度和金属离子辅助因子。结果显示，BtTdT的最适反应pH为7.0，最适反应温度为40°C。在测试的11种金属离子中，Co2+ 、Mg2+ 、Mn2+ 和Zn2+ 能正向促进聚合活性，其中Co2+ 在2 mM浓度下效果最佳。在pH 7.0、43°C和1.5 mM Co2+ 的联合优化条件下，BtTdT表现出最大活性。
3.3. 截短BtTdT以提升催化活性
野生型BtTdT包含BRCT结构域和催化结构域POLXc。先前研究表明，去除BRCT结构域能增强酶的表达、稳定性和DNA延伸活性。研究人员构建了一系列保留不同长度N端序列的BRCT结构域缺失变体。实验发现，所有截短变体（特别是保留了15个氨基酸的Bt15AA）的活性均高于全长BtTdT。这表明合理的N端截短是提升BtTdT催化效率的有效策略。
3.4. BtTdT的定点诱变
为了进一步提升酶对3′-ONH2 –dNTPs的催化效率，研究人员进行了基于结构的定点诱变。首先，借鉴小鼠TdT的研究，将靠近底物结合口袋的Leu397突变为Met，以增强碱基堆积作用，由此得到的M1（Bt15AAL397M ）变体活性提升了1.5倍。接着，参考对ZaTdT（Zonotrichia albicollis TdT）的研究，引入了R336L和K338G双突变，以扩大活性口袋，更好地容纳带有修饰的底物。得到的双突变体M2（Bt15AAR336L/K338G ）活性相比野生型提升了5倍。将这三个突变组合，得到了三重突变体M3（Bt15AAR336L/K338G/L397M ），其催化效率得到了进一步提升。
3.5. 基于AlphaFold 3预测结构的半理性设计
尽管M3活性显著提升，但在处理某些特定末端序列的引发DNA（iDNA）与3′-ONH2 –dATP结合时，转化仍不完全。通过对比M3与高活性ZaTdT突变体的AF3结构模型，研究人员发现M3中Glu456位点（对应ZaTdT的较小氨基酸Gly）可能产生空间位阻。因此，他们针对E456位点设计了20种突变，并用AF3模拟了这些变体与底物类似物ATP的结合构象。模拟预测E456S突变能使底物3′端与酶表面的距离增加最多，可能最大程度减少空间位阻。实验证实，四重突变体M4（Bt15AAR336L/K338G/L397M/E456S ）能在5分钟内实现所有16种iDNA对3′-ONH2 –dATP的完全转化。基于对邻近残基D395的分析，研究人员进一步将其突变为Gly，最终获得了五重突变体M5（Bt15AAR336L/K338G/L397M/E456S/D395G ）。M5展现出惊人的催化效率，能在30秒内近乎完全地催化几乎所有64种iDNA与3′-ONH2 –dNTPs的组合反应。
3.6. 改良突变体的机制分析
为了阐明M5活性大幅提升的分子机制，研究人员比较了从Bt15AA到M5一系列变体与底物ATP的相互作用。他们发现，随着突变的引入，与底物相互作用的氨基酸残基数量从9个减少到6个，极性接触（如氢键和离子相互作用）也从9个减少到5个。这种相互作用的“简化”非但没有削弱催化核心功能，反而可能通过两个协同机制加速催化周转：一是减弱了切割后焦磷酸（PPi）的滞留，从而加快产物释放；二是使得3′-ONH2 –dNTP能更灵活地调整取向，以找到最利于亲核攻击和金属离子配位（Mg2+ /Mn2+ 桥接）的过渡态构象。这种“控制性去稳定化”策略，即去除非必要的、可能限制底物动态的相互作用，是成功的关键。
3.7. 突变体M5的DNA从头合成
最后，研究团队评估了M5用于DNA从头合成的实际潜力。他们建立了一个基于链霉亲和素磁珠的循环合成体系，以3′-ONH2 –dNTPs为“积木”，以M5为“装配工”，进行逐步合成。每个循环包括1分钟的核苷酸掺入和1分钟的亚硝酸脱保护，以再生3′-OH末端。通过10个这样的循环，研究人员成功从头合成了目标序列为5′-ATGGATCCTC-3′的10-nt单链DNA。产物经质谱验证与预期序列一致，累积产率超过80%，计算得出单步掺入效率超过98%，展现了M5在精确、可扩展的酶法DNA合成中的巨大应用潜力。
研究结论与重要意义
本项研究通过“筛选-表征-截短-诱变-半理性设计”的系统性蛋白质工程路径，成功将牛源末端脱氧核苷酸转移酶（BtTdT）改造成了对3′-ONH2 可逆终止子dNTPs具有超高催化活性的工程酶M5。其核心创新与意义在于：
1. 建立了TdT高效工程化的理性框架 ：该工作展示了如何结合生物信息学筛选、结构域理性截短、AlphaFold3结构预测与模拟、以及针对关键位点的半理性饱和突变，快速、高效地获得性能显著提升的TdT变体。这种策略相比传统的、成本高昂的高通量随机筛选，更具方向性和效率。
2. 揭示了提升酶对修饰底物活性的新机制 ：研究通过结构比较和相互作用分析发现，对天然TdT的工程化优化并非简单地扩大活性口袋，而是需要一种“控制性去稳定化”——即精确地削弱或重构底物与酶之间某些非生产性的相互作用，在维持催化核心功能完整性的同时，赋予底物必要的构象灵活性，从而大幅提升催化周转率。这一机制见解对设计其他作用于非天然底物的酶具有普遍启发意义。
3. 创造了迄今报道活性最高的TdT变体之一 ：最终获得的五重突变体M5对3′-ONH2 –dATP的催化效率相比其三突变体前体M3提升了超过30倍，并且展现出广泛的底物兼容性。这为解决酶法DNA合成的核心瓶颈——掺入效率与速度——提供了强有力的工具。
4. 证明了工业级酶法DNA合成的可行性 ：利用M5成功实现10-nt ssDNA的高效、高保真从头合成，单步效率超过98%，是迈向可扩展、长链DNA酶法合成的重要概念验证。这为合成生物学、基因治疗、DNA数据存储等领域对低成本、高质量、长片段DNA的迫切需求提供了极具前景的技术路径。
总之，这项由山东大学Chengjie Zhang、Lei Du、Shengying Li等研究人员完成的工作，不仅成功打造了一把更高效的“DNA合成钥匙”，更重要的是提供了一张绘制这把钥匙的“设计蓝图”，为最终实现绿色、经济、高效的工业化DNA合成奠定了坚实的科学与技术基础。
打赏
