胆囊收缩素（CCK）在雌性 Mandarin 鱼（Siniperca chuatsi）生殖调节中的作用

CCK系统在 mandarin鱼中的克隆与功能分析揭示其通过激活受体调控FSH/LH分泌及性激素合成，影响HPG轴和卵巢发育。

刘双|王崇伟|王玉婷|李超伟|滕金蒙|彭淑涵|林佳琪|张金|林浩然|韩林强|胡菊|李水生|张勇

中国南方海洋科学与工程研究院（珠海）生物控制国家重点实验室与生命科学学院，广东省水生经济动物重点实验室，广东省重要经济鱼类健康养殖工程技术研究中心，中山大学，广州510275。

摘要

胆囊收缩素（CCK）广泛分布于胃肠道和中枢神经系统，通过激活其受体（CCKR）调节多种生理功能。近期研究表明，除了调节摄食和代谢外，CCK还参与了一些鱼类的繁殖调节。CCK与下丘脑-垂体-性腺轴的关键生殖因子之间的关系尚不清楚。此外，目前尚未有针对鲫鱼（Siniperca chuatsi）的CCK相关研究。在本研究中，我们系统地分析了鲫鱼中的CCK系统，包括克隆和鉴定两种形式的CCK（CCKa和CCKb）以及三种CCK受体（CCK1R、CCK2Ra和CCK2Rb），并通过注射外源性CCK-8肽以及将初级垂体和卵巢细胞与该肽共培养来探究CCK对生殖调节的影响。组织分布研究表明，CCK及其受体在下丘脑和垂体中的表达模式存在差异。免疫荧光实验进一步证实了CCK及其受体在下丘脑和垂体中的表达具有显著差异。荧光素酶报告系统显示不同CCK受体对CCK的选择性存在差异。功能实验表明，体内给予CCK-8肽显著上调了下丘脑中gnrh1的表达，并提高了垂体中fshb和lhb的表达，同时促进了性腺类固醇激素的合成和分泌。此外，CCK-8肽与初级垂体细胞的共培养进一步证实CCK可以直接上调fshb的表达，但不影响lhb的表达。此外，CCK可能通过卵巢内的局部产生的CCK来调节卵巢中与卵泡发育和类固醇生成相关的关键基因的表达。这些发现表明CCK在鲫鱼的繁殖调节中起着多方面的作用。

引言

与哺乳动物类似，硬骨鱼类的性成熟过程由下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴调节。促性腺激素释放激素（GnRH）由下丘脑分泌，从而刺激垂体中促性腺激素（GTHs）的合成和分泌。随后，GTHs控制着性腺的发育和性成熟过程（Takahashi等，2016；Zohar等，2010）。GTHs作用于性腺后，通过诱导性激素的分泌来调节性腺发育和性成熟的启动。促卵泡激素（FSH）和黄体生成激素（LH）是两种主要的GTHs，其中FSH主要参与卵母细胞生长阶段，而LH主要参与成熟后期（Patiño等，2001；Kitano等，2022）。在HPG轴中，GTHs的合成通过GnRH介导的正反馈机制得到促进，导致LH和FSH释放到性腺，进而调节性激素的分泌（Mario和Robert，2017；Yang等，2025）。

GnRH通常被认为是生殖的关键调节因子，因为垂体中GTHs的释放直接受到GnRH的刺激。然而，有研究表明，在如青鳉（Oryzias latipes）和斑马鱼（Danio rerio）等硬骨鱼类模型中，GnRH敲除并未影响FSH的功能，这表明GnRH可能不是FSH释放的主要调节因子（Takahashi等，2016；Marvel等，2018）。在青鳉中，gnrh1基因敲除导致无排卵，但卵泡发育正常，性腺体指数（GSI）保持在正常水平（Takahashi等，2016）。同样，在斑马鱼中，gnrh3基因敲除未影响性腺发育，且繁殖功能正常（Spicer等，2016）。此外，由于缺乏哺乳动物类型的中线隆起结构，硬骨鱼类的下丘脑神经元可以直接投射到垂体促性腺细胞区域。因此，GTHs的合成和分泌可以受到多种神经肽的直接调节（Biran等，2015）。

CCK是食物摄入的重要调节因子。在哺乳动物中，CCK是一种脑-肠肽，在进食后由大脑和周围神经元释放，从而抑制食物摄入（Peikin，1989；Rehfeld，2017）。胃泌素与CCK类似，在消化过程中也起着重要作用（Johnson，1977；Dimaline和Varro，2014；Rehfeld，2017）。此外，胃泌素和CCK的基因结构在哺乳动物中高度相似（Deschenes等，1985）。首次发现CCK参与硬骨鱼类摄食调节的证据来自金鱼（Carassius auratus）（Himick和Peter，1994）。随后，在其他硬骨鱼类中也发现了CCK的存在，包括斑点绿河豚（Tetraodon nigroviridis）、日本比目鱼（Paralichthys olivaceus）、钝吻鰕虎鱼（Megalobrama amblycephala）、黄尾鱼（Seriola quinqueradiata）、Schizothorax prenanti、冬鳐（Raja ocellata）和白海鲷（Diplodus sargus）（Kurokawa等，2003；Ping等，2013；Murashita等，2006；Yuan等，2014；MacDonald和Volkoff，2009；Micale等，2012）。已鉴定出三种类型的CCK受体：CCK1（CCK1R）和CCK2（CCK2R）（Wank等，1992；Simpson等，2012）。先前的研究还表明，CCK除了参与摄食和代谢调节外，还与硬骨鱼类的繁殖有关。在金鱼的大脑和垂体中检测到高水平的CCK表达，体外实验表明CCK能诱导垂体释放LH（Himick等，1993；Himick等，1996）。在草鱼（Ctenopharyngodon idella）的下丘脑和垂体中也观察到高水平的cck mRNA（Feng等，2012）。配体激活后，CCK1R和CCK2R均能激活多种信号通路，导致钙离子动员和MAPK/ERK信号级联反应（Zeng等，2020），以及斑马鱼中环腺苷单磷酸（cAMP）水平的升高（Uehara等，2024）。此外，CCK1R和CCK2R的差异表达模式表明CCK在靶组织中具有不同的活性（Miyasaka和Funakoshi，2003）。最近在青鳉中的研究表明，CCK具有FSH释放激素（FSH-RH）的功能，从而调节FSH的分泌（Uehara等，2024）。最新研究还表明CCK是一种强效的FSH-RH，而GnRH则具有LH释放激素（LH-RH）的功能，支持了硬骨鱼类垂体中促性腺激素分泌的双激素调节模型（Kayo等，2025；Uju等，2025）。然而，CCK与HPG轴的关键生殖因子（包括GnRH、GTHs和性激素）之间的关系尚未得到系统研究。

鲫鱼（Siniperca chuatsi）属于鲈形目、鲈科、Sinipercinae亚科和Siniperca属，俗称中国鲈鱼。它广泛分布于中国、越南和韩国的河流流域，因其口感和营养价值而被视为高质量的淡水经济鱼类。目前，养殖主要采用全雌群体，通过将XX型雌鱼诱导发育为功能性雄鱼（neomale），然后与选定的雌鱼进行杂交（Liu等，2020）。这种方法可以实现快速生长、体型均匀和高安全性，从而缩短养殖周期并降低土地和饲料成本。尽管鲫鱼的繁殖技术已迅速发展，但性腺发育仍然需要大量能量，性腺成熟的调节仍是一个关键挑战。因此，当前关于鲫鱼的研究主要集中在性腺发育的调节上。

本研究旨在探讨CCK是否也参与鲫鱼的繁殖调节，以及调节CCK是否可以影响性腺发育，从而为该物种的性腺发育调节提供新的策略和工具。本研究分析了CCK与鲫鱼HPG轴关键生殖因子之间的关系，进一步阐明了CCK对硬骨鱼类性腺发育的调节机制。这些发现为CCK在鱼类中诱导性腺发育的机制提供了宝贵的见解。

动物和药物

健康的、处于不同发育阶段的鲫鱼来自中国广东省佛山市的一个水产养殖场。实验鱼包括一龄鱼（n = 8条，平均体重335.47 ± 2.17克）、两个月龄鱼（n = 60条，平均体重15.17 ± 0.74克）和五个月龄鱼（n = 30条，平均体重92.00 ± 5.37克）。不同发育阶段的鱼用于不同的实验程序。

CCKs和CCKRs的多序列比对及系统发育树分析

在鲫鱼中成功克隆并鉴定了CCKa、CCKb和胃泌素，其编码序列长度分别为516 bp、414 bp和336 bp。CCK和胃泌素的ORF序列（包括核酸和氨基酸）见补充图1。所有成熟肽均由八个氨基酸组成；CCKa和CCKb的八肽序列相同（DYLGWMDF），而胃泌素的序列略有不同（DYQGWVDF）。比较序列分析显示，只有第三和第六个氨基酸序列存在差异

讨论

目前，关于CCK在哺乳动物中的研究主要集中在其摄食调节作用上（Lo等，2010；Garfield等，2014；Costa等，2022）。同样，大多数关于硬骨鱼类中CCK的研究也集中在摄食调节及相关过程上（Lõhmus等，2008；Velasco等，2019），仅有少数研究涉及繁殖。迄今为止，尚未有关于经济型淡水鱼类——鲫鱼中CCK的研究。在本研究中，我们系统地

结论

总之，通过整合分子克隆、受体药理学、组织分布分析以及体内和体外功能实验，本研究基于相同配体/受体在不同组织中的分布模式，系统阐明了CCK在鲫鱼繁殖调节中的关键作用。特别是，CCK在控制FSH合成和卵巢发育方面发挥了重要作用。此外，由于CCK信号通路的作用

CRediT作者贡献声明

刘双：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，验证，方法学，研究，数据管理，概念构思。王崇伟：研究，数据管理。王玉婷：研究，数据管理。李超伟：研究。滕金蒙：研究。彭淑涵：研究。林佳琪：研究。张金：研究。林浩然：撰写 – 审稿与编辑。韩林强：资源获取。胡菊：研究。李水生：资源获取，资金争取。

未引用参考文献

Rehfeld, 2025

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家重点研发计划（项目编号：2024YFD2401500；2024YFD2401505）、贵州省科技规划项目（项目编号：2023-085）、广东省科技规划项目（项目编号：2023B1212060023）、广州市科技规划项目（项目编号：2025D04J0094）以及农业农村部财政资金项目：珍珠水域渔业资源与栖息地调查的支持。