DNA不仅是经典的遗传信息载体，其经典的双螺旋结构早已为人所熟知。然而，DNA还能形成非经典结构，其中DNA三链体正日益被认识到具有重要的生物学功能。这种结构参与基因表达调控、DNA复制暂停，并与遗传不稳定性相关，是连接结构与功能的关键分子之一。生命活动的舞台——细胞内部，是一个高度拥挤的“分子城市”，充满了高浓度的蛋白质、核酸等生物大分子，这种环境被称为分子拥挤环境。它通过增强排除体积效应、降低水活性等方式，深刻影响着生物大分子的结构和动态。DNA三链体的功能由其结构和动态共同决定，其中碱基对的瞬时打开与闭合是调控其与蛋白质相互作用的关键动态过程。然而，在复杂的细胞拥挤环境下，DNA三链体内部每个碱基对究竟是如何“呼吸”的？它们的开合动态会如何被拥挤的环境所改变？过去的研究由于技术限制，难以在生理pH条件下精确测定这些动态参数，使得我们对此知之甚少。
为了解决上述问题，一项发表在《The FEBS Journal》的研究应运而生。研究人员利用核磁共振波谱这一能够在原子分辨率上探测毫秒至亚毫秒时间尺度动力学的强大工具，结合一种新开发的WMT/1H R1ρRD联合分析方法，成功地在生理pH 7.0条件下，定量测定了DNA三链体在模拟分子拥挤环境中的碱基对开合动力学。他们使用了一种可形成平行三链体结构的寡聚脱氧核苷酸作为模型，并采用了两种具有不同作用机制的拥挤剂：Ficoll PM 70（主要增强排除体积效应）和PEG 200（主要降低水活性），以模拟细胞内拥挤环境的不同侧面。
本研究主要采用了以下几种关键技术方法：1. 核磁共振波谱，特别是1H R1ρ弛豫色散和Water-Magnetization-Transfer实验，用于在原子水平测定碱基对的开合交换速率和质子交换速率。2. 紫外光谱，用于测定DNA三链体的热稳定性（熔解温度）。3. 理论计算与建模，基于已知的pKa值、碰撞频率等参数，计算开放状态下的质子交换速率，并结合NMR实验数据求解开合速率常数。研究在体外模拟环境中进行，使用特定的PT-ODN序列和两种拥挤剂。
DNA三链体在分子拥挤环境中的结构
研究人员首先通过一维1H NMR谱图确认，在添加15%的Ficoll PM 70或PEG 200后，DNA三链体的整体结构并未发生显著改变，其亚氨基质子信号谱图与无拥挤剂的稀释条件基本一致。这表明所使用的拥挤剂并未引起三链体结构的重大扰动，为后续专注于动力学研究奠定了基础。
分析碱基对开合动力学的理论框架
研究建立了一个基于两态交换模型的理论框架，将碱基对的开合过程描述为闭合态与开放态之间的动态平衡。通过结合WMT实验测得的质子交换总速率和RD实验测得的构象交换速率，并利用文献及实验参数计算开放状态下的本征质子交换速率，研究人员得以在不改变缓冲液条件（特别是pH 7.0）的情况下，首次求解出控制每个碱基对开合的动力学历程常数。
无和有拥挤剂存在下闭合态与开放态之间的交换速率以及水-亚氨基质子交换速率
通过1H R1ρ弛豫色散实验，研究人员获得了DNA三链体中多个Watson-Crick碱基对和Hoogsteen碱基对的构象交换速率常数。同时，通过WMT实验测定了相应的水-亚氨基质子交换速率。数据分析显示，在两种拥挤环境中，大多数碱基对的交换动力学都发生了改变，且Ficoll PM 70和PEG 200的影响模式不同。
无和有拥挤剂存在下PT-ODN碱基对闭合态与开放态的寿命
基于上述实验和理论计算，研究团队首次在分子拥挤环境下定量获得了DNA三链体各碱基对的开合速率常数，并由此计算出闭合态和开放态的寿命。研究发现，增强排除体积效应的Ficoll PM 70普遍延长了大多数碱基对（无论是WCBPs还是HBPs）的闭合态和开放态寿命。相反，降低水活性的PEG 200则缩短了大多数碱基对的闭合态寿命，同时延长了其开放态寿命（位于螺旋中心附近的T16和T28除外）。这表明两种拥挤剂通过截然不同的物理机制影响着碱基对的动态。
无和有拥挤剂存在下PT-ODN碱基对的ΔG°值
进一步计算闭合态与开放态之间的标准吉布斯自由能差（ΔG°）发现，在无拥挤剂条件下，Hoogsteen碱基对的ΔG°值普遍低于Watson-Crick碱基对，表明HBPs更倾向于处于开放态，这一趋势在不同拥挤环境下依然保持。Ficoll PM 70的加入增大了部分HBPs的ΔG°，意味着其闭合态相对更稳定；而PEG 200的加入则降低了一些碱基对的ΔG°，使其开放态的相对稳定性增加。
三链体结构的热稳定性
最后，通过紫外熔解曲线分析发现，虽然两种拥挤剂显著改变了DNA三链体内部的碱基对动态，但对其整体热稳定性影响有限，熔解温度变化不大。这突显了分子拥挤环境对核酸动态特性的精细调控可能独立于对其整体热稳定性的影响。
本研究通过精密的NMR动力学分析结合理论建模，首次在原子分辨率水平揭示了不同分子拥挤环境对DNA三链体碱基对开合动力学的差异化调控机制。核心结论在于：尽管整体三链体结构得以维持，但分子拥挤环境显著重塑了其内部动态景观。Ficoll PM 70主要通过增强排除体积效应，稳定碱基对的闭合态，从而整体上倾向于稳定三链体结构；而PEG 200则通过降低水活性，倾向于延长开放态寿命、缩短闭合态寿命，从而在动力学上“松动”了碱基对，可能使三链体更容易发生局部开放，更易于与其他分子（如蛋白质）发生相互作用。这些发现具有深远意义。首先，它深化了我们对细胞内拥挤环境如何影响非经典DNA结构动态的理解，将拥挤效应的认知从整体热稳定性拓展到了单个碱基对的动力学层面。其次，研究开发的WMT/RD联合分析方法，实现了在生理pH下精确测定核酸动态参数，为在更接近生理的条件下研究其他核酸结构（如双链、四链体）的动态特性提供了强有力的新技术。最后，考虑到细胞内拥挤程度会随细胞周期、衰老等过程而变化，该研究提示DNA三链体的动态特性可能作为一种敏感的“分子感受器”，响应细胞内环境的变化，进而通过调控其与蛋白质的相互作用来影响基因表达和基因组稳定性等关键细胞功能，为理解拥挤环境下的基因调控提供了新的视角和机制线索。
