综述：CRISPR/Cas12a激活模式的最新进展：实现多功能且可靠的诊断应用

CRISPR/Cas12a激活机制在诊断中的应用与优化策略。

谢思颖|王树林|胡一琳|吕伟|李炳志

南京师范大学食品科学与制药工程学院，中国南京211166

摘要

CRISPR/Cas12a已成为一种极具前景的工具，可用于现场部署和即时诊断。然而，传统激活模式存在一些限制，包括对PAM（短回文重复序列）的依赖性、检测灵敏度有限、单核苷酸识别能力不足以及目标类型有限。最近在调节Cas12a激活机制和开发替代激活模式方面的努力显示出克服这些限制的巨大潜力。本文系统概述了CRISPR/Cas12a的激活模式，这一主题此前很少被总结。首先，我们介绍了Cas12a的传统激活模式及其在诊断应用中的局限性。接着，我们重点介绍了预阻断激活模式和新兴激活模式，并探讨了它们在广泛诊断中的应用。最后，我们总结了这些激活策略对诊断技术的贡献，并展望了未来的发展趋势。通过采用多种Cas12a激活策略，可以开发出更具灵活性的基于CRISPR/Cas12a的检测方法，从而拓展其应用范围。

引言

CRISPR/Cas（成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白）系统利用CRISPR RNA（crRNA）和CRISPR相关蛋白（Cas）来特异性识别和切割入侵的核酸[1]、[2]、[3]、[4]。第2类CRISPR系统适合作为生物分子工具，因为它们仅依赖一个Cas酶来发挥作用[5]、[6]、[7]、[8]。CRISPR/Cas9系统是首个被开发用于基因编辑的工具[9]、[10]、[11]。2016年，Collins团队率先将CRISPR/Cas9用于寨卡病毒检测，这标志着分子诊断领域的重大突破[12]。后来发现，Cas13a、Cas12a和Cas14具有Cas9所不具备的跨切割活性，能够对单链核酸进行非特异性、多次切割[13]、[14]、[15]。基于此，研究人员建立了SHERLOCK（特异性高灵敏度酶报告解锁）和DETECTR（DNA内切酶靶向CRISPR转录报告系统）平台用于核酸检测[16]、[17]。这些平台具有与PCR相当的灵敏度和特异性，同时满足快速检测和最小化仪器需求的要求，使其成为医院、即时诊断和家庭检测的理想选择。在COVID-19疫情期间，这些技术通过检测SARS-CoV-2展示了其临床诊断潜力[18]、[19]。目前，基于CRISPR的诊断技术仍是体外诊断研究的热点。

利用CRISPR/Cas系统激活相关的分子成分对于开发基于CRISPR的诊断平台至关重要。这些成分包括crRNA、Cas酶以及作为Cas激活激活剂和被激活Cas酶切割底物的序列。crRNA包含一个与Cas酶结合的重复序列和一个可编程以附着到目标序列上的间隔序列[20]。当crRNA与Cas酶结合时，Cas酶可以特异性结合目标序列并触发顺式切割和跨切割反应。在诊断应用中，crRNA-Cas核糖核蛋白（Cas RNP）通常使用目标特异性crRNA来识别与疾病相关的核酸，然后利用Cas酶进行信号读取。例如，将荧光蛋白与Cas融合可以实现原位基因组成像[21]。Cas的顺式切割可以间接引发荧光或比色反应[22]、[23]。大多数CRISPR检测方法利用Cas酶（如Cas12a、Cas13a、Cas14）的跨切割活性来切割信号探针[24]、[25]、[26]。典型的探针是带有荧光基团和淬灭剂的单链DNA或单链RNA[27]、[28]。在目标序列存在的情况下，激活的Cas酶会切割报告探针，产生荧光信号。这意味着单个目标序列可以激活单个Cas酶，触发多轮探针切割，使Cas酶成为信号放大器。为了进一步增强检测信号，探针可以被设计成发夹结构、三链或四链形式[29]、[30]、[31]、[32]。这些改进还可以应用于金纳米颗粒[33]、[34]、[35]、上转换发光材料[36]、[37]或其他强信号材料[38]、[39]。借助这些设计，基于CRISPR的诊断技术现在可用于病原体检测[40]、[41]、[42]、[43]、[44]、癌症筛查[45]、[46]、治疗监测[47]、[48]以及即时检测（POCT）[49]、[50]。

CRISPR/Cas12在分子诊断中得到了广泛应用，并取得了显著成功。尽管之前的综述已经涵盖了CRISPR/Cas12a在特定诊断中的应用及其与其他技术的集成[51]、[52]、[53]、[54]、[55]、[56]、[57]、[58]，但其激活模式在提升诊断能力方面的作用仍需进一步研究。如图1所示，本文首先详细介绍了CRISPR/Cas12a的传统激活模式及其在诊断应用中的局限性。我们重点介绍了扩展检测应用的预阻断激活模式和新兴激活模式，并讨论了它们的诊断优势及未来发展方向。

CRISPR/Cas12a的传统激活模式及其在诊断中的局限性

在CRISPR/Cas12a的传统激活模式下，crRNA引导的Cas12a结合含有PAM（短回文重复序列）的dsDNA或前间隔序列，从而触发目标DNA的切割（顺式）和任意单链DNA的降解（跨式）[14]。这一激活过程涉及Cas12a上的多个关键结构域，如楔形结构域（WED）、PAM相互作用结构域（PI）、核酸酶结构域（Nuc）和RuvC[59]。具体而言，在切割dsDNA时，WED和PI结构域与富含T碱基的PAM相互作用，从而松开目标序列的结合。

采用预阻断策略的传统激活模式

通过对CRISPR/Cas12a传统激活机制的理解，现在可以精确调控其激活状态。预阻断策略（也称为激活开关）通过屏蔽参与激活过程的关键成分来抑制Cas12a的激活，使系统保持在关闭状态。当去除这种阻断效果后，系统会恢复到可激活状态。这种激活模式已在诊断应用中得到成功应用。

Cas12的新兴激活模式

除了传统激活模式外，研究人员还探索了新的Cas12a激活方式。全长crRNA或激活剂可以被分割成片段，同时保持活性。此外，dsDNA激活剂可以以不依赖于PAM的方式触发Cas12a的激活。如表2所示，这些新方法已成功应用于诊断领域。

结论与展望

近年来，CRISPR/Cas12a得到了广泛研究，从基础激活机制到多种诊断应用都有涉及。与以往的综述不同，本文强调了合理设计CRISPR/Cas12a激活模式对其诊断应用范围的持续扩展。具体而言，我们全面了解了经典的Cas12a激活模式及其在诊断中的固有限制。

CRediT作者贡献声明

王树林：撰写 – 审稿与编辑、可视化、软件开发、数据整理。吕伟：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、指导、资金获取。胡一琳：初稿撰写、实验研究、概念构思。谢思颖：初稿撰写、可视化、数据分析。李炳志：审稿与编辑、初稿撰写、资金获取、数据分析、概念构思

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

竞争利益声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了江苏省合成生物学基础研究中心（BK20233003）、国家自然科学基金（项目编号82304414）、无锡市卫生健康委员会青年和中年人才支持计划（HB2023103）、无锡市青年科技人才支持行动（TJXD-2024-107）、江阴市卫生健康委员会重点科学基金（K202101）以及国家卫生健康委员会核医学重点实验室和江苏省重点实验室的支持。