食管鳞状细胞癌（ESCC）是全球范围内常见的恶性肿瘤，发病率居第11位、死亡率居第7位，其中鳞状细胞癌亚型占比高达85%-90%。尽管手术是早期患者的首选治疗，但晚期或转移性疾病的治疗选择有限，传统含铂化疗方案的中位总生存期通常不超过12个月。近年来，免疫检查点抑制剂（ICIs）为ESCC治疗带来新希望，尤其是联合化疗在围手术期和一线治疗中显示出显著疗效，但如何精准识别适合免疫治疗的患者群体仍是临床面临的重大挑战。这一困境的核心在于ESCC的高度异质性——肿瘤基因组和肿瘤微环境（TME）的复杂性导致患者对治疗的反应差异显著。与此同时，CD8+ T细胞作为抗肿瘤免疫的核心效应细胞，其在肿瘤微环境中的分化状态（如耗竭状态）直接影响免疫治疗疗效，但目前缺乏基于CD8+ T细胞动态分化的ESCC系统性分子分型研究。
为破解这一难题，研究团队以“CD8+ T细胞分化状态定义ESCC分子亚型及其临床意义”为核心科学问题，整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）、批量RNA测序（Bulk-RNA）、孟德尔随机化（MR）分析及体外细胞实验，构建了基于CD8+ T细胞分化相关基因的ESCC分子亚型，深入解析了各亚型的生物学特征、基因组变异、免疫微环境及治疗响应差异，并验证了关键基因RHOB的功能。该研究揭示了CD8+ T细胞分化轨迹与ESCC分子特征的关联，为精准分型和治疗策略制定提供了新视角，相关成果发表于《Frontiers in Immunology》。
研究主要采用以下关键技术方法：样本队列来源于GEO数据库的scRNA-seq数据集GSE188900（7例肿瘤、1例正常样本）和Bulk-RNA数据集GSE53625（n=358）、GSE104958（n=46），以及TCGA数据库的TCGA-ESCA队列（95例ESCC肿瘤、11例匹配正常样本，排除78例食管腺癌样本）。通过Seurat包进行scRNA-seq数据预处理（质控、Harmony去批次）、Monocle2进行CD8+ T细胞拟时间分析；利用非负矩阵分解（NMF）基于CD8+ T细胞分化相关基因对Bulk-RNA数据进行分子亚型构建；采用limma包差异分析、clusterProfiler包进行GO/KEGG基因集富集分析（GSEA）；通过MaTools包和cBioPortal数据库分析体细胞突变与拷贝数变异（CNV）；利用ssGSEA评估28种免疫细胞浸润，结合TIS评分、TIDE评分、Submap算法预测免疫治疗响应；通过OncoPredict和CMap数据库筛选潜在治疗药物；采用两样本孟德尔随机化（TwoSampleMR包）分析CD8+ T细胞相关基因与ESCC风险的因果关系；通过CCK-8、Transwell、划痕实验验证关键基因RHOB对ESCC细胞功能的影响。
3.1 Single-cell atlas of immune cells
对GSE188900数据集的19,427个免疫细胞进行质量控制后，通过t-SNE聚类分为16个亚群，经SingleR包注释为B细胞、浆细胞、单核细胞、肥大细胞和T细胞5个主要亚群，其中T细胞占比最高。该结果明确了ESCC肿瘤微环境中免疫细胞的组成特征，为后续聚焦CD8+ T细胞研究奠定基础。
3.2 Pseudotime analysis of CD8+ T cells
利用Monocle2对T细胞进行拟时间分析，将T细胞分为4个亚型，其中簇0和簇2为CD8+ T细胞（高表达CD8A/CD8B），簇1和簇3为CD4+ T细胞（高表达LEF1/SELL）。CD8+ T细胞C2亚型高表达HAVCR2、LAG3、TIGIT、PDCD1、TNFRSF9等免疫检查点分子，拟时间分析显示其沿分化轨迹向耗竭状态演进，提示该亚型为耗竭性CD8+ T细胞集合。
3.3 NMF identifies molecular subtypes associated with CD8+ T cells
从scRNA-seq数据中提取51个CD8+ T细胞分化相关基因，通过NMF对TCGA队列分析确定最佳聚类数为3（C1：64例，C2：52例，C3：36例），共识矩阵显示聚类边界清晰。生存分析表明C2亚型患者总生存期（OS）显著优于C1和C3（P<0.05），多变量Cox回归证实C2为独立预后因素；GSE53625验证队列得到一致结果，验证了分子亚型的稳健性。
3.4 Enrichment analysis
GSEA显示C1亚型显著富集细胞外基质（ECM）组织、ECM受体相互作用、TGF-β/Wnt/Hippo信号通路（与肿瘤生长转移相关）；C2亚型富集核糖体、氧化磷酸化、核苷酸切除修复等代谢与DNA修复通路；C3亚型富集适应性免疫反应、Th17/Th1/Th2细胞分化、细胞因子-细胞因子受体相互作用等免疫相关通路，揭示各亚型功能异质性。
3.5 Gene mutation analysis
Maftools分析显示TCGA队列中TP53和MUC16为最常见突变基因。C1亚型TP53突变率最高，C3亚型TTN和MUC16突变更显著，C2亚型突变频率最低。cBioPortal分析显示C1亚型拷贝数变异（CNV）最丰富，CDKN2A基因纯合缺失频率最高（与ESCC免疫逃逸相关），提示C1亚型基因组不稳定性高。
3.6 Immune infiltration analysis and immunotherapy evaluation
ssGSEA显示C3亚型免疫细胞浸润最丰富（记忆B细胞、活化B细胞、活化树突状细胞、CD4+ /CD8+ T细胞等），被称为“免疫热”亚型（P<0.05）。C3亚型高表达PDCD1（PD-1）、CTLA-4、LAG3等免疫检查点分子及HLA抗原呈递分子。TIS评分（C3最高）、Submap分析（C3对anti-PD-1响应佳）和TIDE评分（C1最高，提示免疫逃逸）均表明C3亚型更适合免疫治疗。
3.7 Screening for small molecules and drug sensitivity analysis
GSE104958队列显示C3亚型对DCF疗法（多西他赛/顺铂/氟尿嘧啶）响应理想。OncoPredict预测C1对奥拉帕尼、雷帕霉素敏感，C2对阿法替尼、厄洛替尼敏感，C3对阿昔替尼、奥希替尼敏感。CMap筛选显示C1候选小分子包括MLN-4924、林非尼布等，C2包括LY-2140023、PD-168077等，C3包括HLI-373、Torin-2等，为个性化用药提供依据。
3.8 MR analysis
孟德尔随机化分析显示，遗传预测的RHOB、HLA-DRB1、IL7R、APOBEC3G高表达与ESCC风险增加相关（P<0.05），工具变量F统计量>10，无弱工具偏倚，提示CD8+ T细胞相关基因对ESCC发病具有遗传影响。
3.9 RHOB was able to promote the proliferation, migration and invasion of ESCC cells in vitro
TCGA-ESCA和GSE53625队列显示ESCC组织中RHOB表达低于正常组织。通过siRNA敲低TE-1和KYSE150细胞的RHOB后，qRT-PCR验证敲低效率，CCK-8实验显示增殖能力下降，Transwell和划痕实验显示迁移和侵袭能力显著降低，证实RHOB可促进ESCC细胞体外增殖、迁移和侵袭。
研究结论与讨论部分强调，该研究首次基于CD8+ T细胞分化轨迹构建了ESCC的3种分子亚型，系统揭示了各亚型在预后、生物学功能、基因组变异及免疫微环境中的差异：C1亚型表现为高基因组不稳定性（TP53突变、CDKN2A缺失）、预后差；C2亚型富集代谢与DNA修复通路、突变率低、预后佳；C3亚型呈“免疫热”表型，高免疫细胞浸润、高免疫检查点表达，对免疫治疗响应更佳。同时，通过孟德尔随机化和体外实验证实RHOB是ESCC的风险基因，可促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。
该研究的重要意义在于：其一，突破了传统基于单一组学的ESCC分型局限，将CD8+ T细胞分化动态与分子亚型构建相结合，为理解ESCC免疫异质性提供了新框架；其二，明确了C3亚型作为“免疫热”肿瘤的分子特征，为临床筛选免疫治疗获益人群提供了可量化的生物标志物（如TIS评分、免疫检查点表达）；其三，鉴定出RHOB等关键驱动基因，并通过多组学分析和功能实验验证了其作用机制，为开发靶向RHOB的新型治疗策略奠定了实验基础；其四，通过跨队列验证（TCGA、GSE53625、GSE104958）确保了结果的稳健性，为后续转化研究和临床试验设计提供了可靠依据。尽管研究存在scRNA-seq样本量较小、药物敏感性基于生信预测等局限性，但其提出的“CD8+ T细胞分化导向的分子分型体系”仍为ESCC精准医疗开辟了新路径，有望推动个体化免疫治疗策略的临床应用。
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