普什帕·亚达夫（Pushpa Yadav）|普雷迪迪亚·巴布·E（Preedia Babu E）|里图·科斯拉（Ritu Khosla）|阿努帕玛·库马里（Anupama Kumari）|查加恩·比哈里（Chhagan Bihari）|苏克里蒂·巴韦贾（Sukriti Baweja）|里迪希·夏尔马（Riddhi Sharma）|盖亚特里·拉玛克里希纳（Gayatri Ramakrishna）|努诺·维加斯（Nuno Viegas）|希夫·库马尔·萨林（Shiv Kumar Sarin）|尼鲁普玛·特雷汉帕蒂（Nirupma Trehanpati）
分子与细胞医学系，肝脏与胆道科学研究所，D-1，瓦桑特昆杰（Vasant Kunj），德里（110070），印度
摘要
肝细胞癌（HCC）是一种生长迅速的癌症，目前可用的医疗疗法效果并不理想。HCC表现出显著的异质性，这可能与大量增殖的EpCAM+癌干细胞（CSCs）的存在有关。我们的目标是开发装备有抗EpCAM适配体的细菌外膜囊泡（OMVs），并装载化疗药物多柔比星（DOX），以通过特异性靶向CSCs发挥抗肿瘤作用。通过体外研究评估了抗EpCAM适配体与HCC细胞系及其球状体的结合效率。使用MTT实验研究了毒性。还通过分子对接技术评估了适配体与EpCAM的结合强度。从沙门氏菌（Salmonella typhimurium）中分离并纯化的OMVs与适配体-连接器复合物混合后，用于装载DOX，从而形成了Apt-DOX-OMVs。在4-5周大的裸鼠体内模型中评估了这些新型Apt-DOX-OMVs的疗效。流式细胞术分析显示，抗EpCAM适配体能够高效结合肝癌细胞，其中SyL3C DNA适配体的结合亲和力最强。MTT实验表明，即使经过72小时的处理，适配体对细胞也没有毒性作用。分子对接结果显示EpCAM与SyL3C的相互作用较强。因此，进一步选择了SyL3C DNA适配体进行体内研究，结果显示Apt-DOX-OMVs组在14天治疗后的肿瘤负荷减少了近50%，肿瘤坏死率约为80%，而单独使用Apt-DOX、DOX或OMVs时效果较差。Apt-DOX-OMVs在体内表现出良好的生物安全性，对小鼠体重、AST/ALT水平和主要器官的组织形态没有显著影响。我们开发了这种新型的、针对EpCAM的OMVs，能够将多柔比星直接递送至CSCs。
章节摘录
引言
全球肝癌的发病率正在上升，预计从2020年到2040年将增加近55%，到2040年将达到约140万例[1]。肝细胞癌（HCC）占原发性肝癌病例的90%，是癌症相关死亡的第三大原因[2]。直到不到十年前，多激酶抑制剂索拉非尼（sorafenib）仍是唯一获批用于不可切除肿瘤的药物。目前，如乐伐替尼（lenvatinib）和瑞戈非尼（regorafenib）等药物已投入临床使用。
使用的化学物质及其他试剂
本研究中使用的化疗药物为多柔比星盐酸盐（DOX；Sigma-Aldrich，D1515）。MES hydrate（Sigma-Aldrich，M2933-25G）、N-羟基琥珀酰亚胺（Sigma-Aldrich，130672-5G）和N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐（Sigma-Aldrich，E7750-5G）用于适配体和连接器的碳二亚胺介导的偶联反应。DSPE-PEG-COOH连接器（Avanti Polar Lipids, Inc.，880135P-10MG）用于表面功能化。
抗EpCAM适配体能高效结合肝癌细胞
首先，通过流式细胞术确定了HepG2和Huh-7细胞系中EpCAM+细胞的百分比。根据先前的研究数据[26]，HepG2细胞系中的EpCAM+细胞比例（80.2%）高于Huh-7细胞系（64.3%）（见图S2）。
利用流式细胞术评估了DNA适配体SyL3C和EP166以及RNA-DNA杂交阳性适配体与HepG2细胞系的结合效率。
讨论
肝细胞癌是最常见的肝癌类型，由于其预后较差而成为一个日益严重的问题[32]。许多患者确诊时已处于晚期，因此不适合进行手术切除或肝脏移植。尽管有多种治疗方法，包括化疗和免疫疗法，但其疗效仍然有限。多柔比星是一种化疗药物，通过插入DNA并抑制RNA和DNA的复制来发挥作用。
作者贡献声明
里图·科斯拉（Ritu Khosla）： 撰写初稿、进行研究、进行正式分析、数据管理。
普雷迪迪亚·巴布·E（Preedia Babu E）： 验证结果、进行研究、进行正式分析、数据管理。
查加恩·比哈里（Chhagan Bihari）： 数据可视化。
阿努帕玛·库马里（Anupama Kumari）： 进行研究。
里迪希·夏尔马（Riddhi Sharma）： 进行研究、数据管理。
苏克里蒂·巴韦贾（Sukriti Baweja）： 数据可视化、方法学设计。
努诺·维加斯（Nuno Viegas）： 撰写、审稿与编辑、方法学设计、进行研究、数据管理。
盖亚特里·拉玛克里希纳（Gayatri Ramakrishna）： 撰写、审稿与编辑、方法学设计。
希夫·库马尔·萨林（Shiv Kumar Sarin）： 撰写、审稿。
伦理批准
所有动物实验均遵循CCSEA和ARRIVE 2.0指南，并按照美国国立卫生研究院（NIH）关于实验室动物护理和使用的指南（NIH出版物编号8023，1978年修订版）进行。动物实验遵循德里肝脏与胆道科学研究所比较医学中心的标准操作程序，并获得了该研究所动物伦理委员会的批准。
出版同意
所有作者均同意提交的研究成果的发表。
数据可用性声明
本研究中生成和/或分析的数据可应要求提供给相应作者。
利益冲突声明
努诺·维加斯博士（Dr. Nuno Viegas）隶属于Mantis Therapeutics公司，该公司负责生产用于制备OMVs的细菌载体。其他作者均无需要报告的利益冲突。
财务披露
无需要披露的财务信息。
资助
本研究得到了DBT 和EuroStars Eureka （BT /IN/Global Stars/79/SKS ）的支持。
利益冲突声明
所描述的工作此前未以预印本、摘要、已发表的演讲、学术论文或注册报告的形式发表。
本文未在其他地方接受发表审查。
本文的发表已获得所有作者的同意，以及开展研究所在机构的明确或默示批准。
如果被接受，本文不会以相同形式或任何其他语言在其他地方发表。
致谢
我们还要感谢肝脏与胆道科学研究所（ILBS）的技术人员在对动物实验中的支持。其中一位作者普什帕·亚达夫（Pushpa Yadav）感谢大学资助委员会（UGC）为她提供的博士奖学金支持。
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