岩尾隆（Takuro Iwao）、高田冬子（Fuyuko Takata）、田中康义（Yasuyoshi Tanaka）、有田仁孝（Hisataka Aridome）、水口淳子（Junko Mizoguchi）、土口信也（Shinya Dohgu）
福冈大学药学部药学保健与健康科学系，日本福冈市城南区南熊19-1，814-0180
摘要
二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）是不饱和的ω-3脂肪酸，通过保护血脑屏障（BBB）功能来降低阿尔茨海默病和痴呆症的风险。然而，DHA和EPA调节BBB功能的机制尚不清楚。DHA和EPA作为过氧化物酶体增殖激活受体（PPAR）的配体发挥作用，PPAR是一种核受体超家族成员，具有α、β和γ三种亚型。脑内皮细胞之间形成的紧密连接（TJs）在限制物质通过BBB的旁细胞传递中起核心作用。本研究旨在探讨DHA和EPA是否通过PPAR调节TJ蛋白的表达。实验中使用了从Wistar大鼠分离出的原代培养的大鼠脑内皮细胞（RBECs）。通过Western blot分析测量了RBECs中的TJ蛋白（ZO-1、occludin和claudin5）以及PPARα、β和γ的表达水平。此外，为了验证PPAR在TJ蛋白表达调节中的作用，将RBECs分别与DHA或EPA以及PPARα、β或γ抑制剂共同处理。PPARβ抑制剂抑制了DHA诱导的ZO-1上调；PPARβ或PPARγ抑制剂均抑制了DHA诱导的occludin增加，而两种PPAR抑制剂均抑制了DHA诱导的claudin-5增加。总之，DHA和EPA通过不同的PPAR在脑内皮细胞中调节TJ蛋白表达，这为预防或治疗神经退行性疾病提供了潜在靶点。
引言
血脑屏障（BBB）由脑微血管内皮细胞（BMECs）以及周围的脑周细胞和星形胶质细胞组成（Abbott等人，2006年）。BBB也被称为神经血管单元（NVU），因为其组成部分与周围的颅神经细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞相互作用以维持大脑神经功能（Zlokovic，2008年）。BMECs具有高度发达的紧密连接（TJ）相关蛋白，包括跨膜蛋白（如claudin和occludin）和胞质内蛋白（如ZO-1）（Konig等人，2025年）。TJ通过加强BMECs之间的连接来调节循环系统与脑实质之间的旁细胞通路通透性，BMECs是BBB的关键组成部分（Hawkins和Davis，2005年）。除了紧密连接外，BBB的完整性还通过血管内皮钙黏蛋白介导的黏附连接得以维持，这些黏附连接与紧密连接复合体共同作用以保持内皮屏障的稳定性（Daneman和Prat，2015年）。紧密连接中的蛋白通过ZO-1等支架蛋白与肌动蛋白细胞骨架相连，有助于维持连接结构的稳定性并调节屏障通透性（Hawkins和Davis，2005年）。此外，BBB的通透性还受到囊泡跨细胞转运和选择性转运系统的控制，这些系统包括ATP结合盒转运蛋白和溶质载体转运蛋白，它们调节分子在内皮细胞中的进出（Daneman和Prat，2015年）。BMECs、周围周细胞和星形胶质细胞足之间的相互作用也通过信号通路在诱导和维持BBB特性中起关键作用（Abbott等人，2006年；Zlokovic，2008年）。BBB功能的破坏会导致有毒物质从循环系统进入大脑，从而导致颅神经功能异常（Daneman和Prat，2015年）。阿尔茨海默病（AD）患者的脑内BBB结构受损，这种损伤与疾病进展有关（Yue和Hoi，2023年）。二十二碳六烯酸（DHA）是一种丰富的ω-3多不饱和脂肪酸（PUFA），从胎儿期到老年期都是维持颅神经功能所必需的营养素（Innis，2007年）。此外，DHA还参与多种神经生理功能，包括细胞存活调节、神经炎症、神经发生和信号转导（Lacombe等人，2018年）。尽管DHA在大脑中含量丰富，但人类大脑自身合成DHA的能力有限（Barceló-Coblijn和Murphy，2009年）。因此，血浆中的DHA需要通过BBB运输到大脑以维持其水平（Echeverría等人，2017年）。DHA可以通过多种途径从血液运输到大脑（Nguyen等人，2014年；Pan等人，2015年）。二十碳五烯酸（EPA）是另一种具有类似DHA神经保护作用的ω-3 PUFA，在大脑中的含量较少（Ouellet等人，2009年；Chen等人，2013年）。流行病学研究表明，血液（血浆和红细胞膜）中高水平的DHA和EPA可以降低AD和认知衰退的风险（Schaefer等人，2006年；Samieri等人，2008年；Otsuka等人，2014年；Melo van Lent等人，2021年；Chu等人，2022年；Sala-Vila等人，2022年）。此外，血液中ω-3 PUFA水平较高的健康老年人表现出较低的BBB通透性（Barnes等人，2021年），这表明血液中ω-3 PUFA水平可能与BBB完整性相关。因此，血液中高水平的DHA和EPA通过保护BBB来降低AD和痴呆症的风险。体内实验也表明，DHA和EPA在病理条件下对BBB损伤具有保护作用（Chen等人，2016年；Liu等人，2020年；Shin等人，2023年；Wen等人，2024年）。多项研究还记录了ω-3 PUFA调控BBB功能的分子机制。ω-3 PUFA通过抗炎途径调节紧密连接相关蛋白的表达和定位，并增强内皮屏障功能，同时改变细胞膜（Calder，2015年）。此外，ω-3 PUFA可以改变细胞膜的脂质组成和 caveolae 的结构，从而影响 caveolin-1 及其下游信号通路的定位，进而调节内皮通透性（Ma等人，2004年）。这些研究表明，包括紧密连接调节、caveolae相关信号传导和膜结构改变在内的多种机制可能负责ω-3 PUFA对BBB完整性的保护作用。然而，DHA和EPA的差异机制仍不清楚。脂肪酸（如DHA、EPA和亚油酸）及其代谢物（前列腺素）是过氧化物酶体增殖激活受体（PPARs）的内源性配体/促进剂。PPARs是核受体，以配体依赖的方式调节转录。PPARs与配体结合形成异二聚体，并作为转录因子参与目标基因的启动子区域调控基因表达（Tyagi等人，2011年）。然而，ω-3 PUFA如何调节BBB完整性以及DHA和EPA对BBB功能的影响是否存在差异仍不清楚。
本研究旨在探讨DHA和EPA是否通过PPAR调节TJ蛋白的表达，并阐明DHA和EPA增强BBB功能的机制。我们的发现将为预防或治疗神经退行性疾病提供潜在靶点。
实验部分
动物
<所有动物实验均获得福冈大学实验动物护理和使用委员会的批准[许可证编号：2204002（批准日期：2022年4月11日）和2315117（批准日期：2024年3月19日）。所有动物实验均符合arrive指南，并遵循美国国立卫生研究院关于实验动物护理和使用的指南（nih出版物编号8023，修订于1978年）。实验使用的wistar大鼠为3-4周龄的雄性和雌性大鼠，购自japan>DHA和EPA对RBEC细胞存活率的影响
<为了研究dha和epa对rbec细胞存活率的影响，将细胞暴露于dha或epa（0.1–100 μm）处理24小时后，使用wst-8评估细胞存活率。结果显示，在浓度低于5 μm时，dha和epa处理组的细胞存活率高于对照组；而在浓度高于或等于30 μm时，细胞存活率降低（图1a，b）。单因素方差分析表明dha和epa处理对细胞存活率有显著影响（图1a：f=>p讨论
< /><首先，我们使用wst测定法和xcelligence rtca s16系统评估了dha或epa对rbec细胞存活率的影响。结果显示，在浓度低于5 μm时，dha和epa显著提高了细胞存活率；而在浓度超过30>CRediT作者贡献声明
岩尾隆（Takuro Iwao）： 数据可视化、项目管理、研究设计、资金获取、概念构思、初稿撰写。高田冬子（Fuyuko Takata）： 资金获取、审稿与编辑。田中康义（Yasuyoshi Tanaka）： 数据可视化。有田仁孝（Hisataka Aridome）： 研究。水口淳子（Junko Mizoguchi）： 研究。土口信也（Shinya Dohgu）： 监督、项目管理、资金获取、审稿与编辑。利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。资助方未参与研究设计、数据收集与分析、手稿撰写或结果发表的决定。致谢
我们感谢Mao Takao女士、Maruyama Aika女士、Yasunaga Miho博士、Yokoya Miki博士和Matsumoto Junichi博士提供的优秀技术支持。同时感谢Editage（www.editage.com）提供的英语语言编辑服务。
