转录因子CcHSFA3通过CcCHLH和CcLUT5负调控采后柑橘果实的着色过程

柑橘果实采后着色由叶绿素降解和类胡萝卜素积累共同驱动，温度是关键调控因素。本研究通过RNA-seq筛选发现热 shock转录因子CcHSFA3在25℃储存的脐橙中显著调控着色进程，其核膜定位特性及转录激活功能经农杆菌瞬时表达和病毒诱导基因沉默系统验证。CcHSFA3负调控叶绿素合成关键酶基因CcCHLH，同时抑制类胡萝卜素合成基因CcLUT5，揭示Hsf家族因子通过协同调控色素代谢通路实现柑橘着色调控的分子机制。

王丽蕾|彭乐萱|谢玉琳|邓莉莉

西南大学食品科学学院，中国重庆400715

摘要

柑橘类水果的颜色变化过程表现为类胡萝卜素的积累和叶绿素的降解，这两者共同促进了果皮颜色从绿色向黄色的转变。温度是调节柑橘类水果采后颜色变化的关键环境因素。初步研究发现，在重庆地区，25℃的储存条件会加速柑橘类水果的采后颜色变化。然而，在此过程中调控类胡萝卜素生物合成和叶绿素降解的转录水平上的协同调控机制尚不清楚。本研究通过RNA-seq数据分析，发现了一种名为的转录因子，该因子可能在调控柑橘类水果着色过程中发挥重要作用，并进一步分析了其在类胡萝卜素生物合成和叶绿素降解调控网络中的潜在作用。研究结果表明是一种核膜共定位蛋白，具有转录激活活性。在农杆菌介导的瞬时过表达系统中，通过抑制类胡萝卜素生物合成和叶绿素降解来延缓柑橘果皮的着色。相反，在VIGS沉默系统中，它则直接促进这两个过程。进一步的实验表明能够协同激活类胡萝卜素生物合成基因和参与叶绿素合成的关键限速酶基因。这些发现为研究柑橘类水果中类胡萝卜素和叶绿素代谢的协同调控机制提供了理论支持，同时也丰富了HSF转录因子家族的功能研究。

引言

柑橘类水果是最受欢迎的新鲜水果之一，因其丰富的营养价值和风味而受到消费者的喜爱。颜色是新鲜水果品质的关键指标之一，直接影响其商业价值和市场竞争力（Vadiveloo等人，2019年）。在柑橘类水果成熟过程中，果皮颜色从最初的绿色转变为黄色或橙红色，这一变化主要由叶绿素的降解和类胡萝卜素的积累驱动。然而，早熟柑橘类水果由于在成熟期间低温积累不足，其果皮着色往往滞后于果肉的成熟，导致果实颜色不均匀，严重影响外观质量和商业价值。为了解决这一问题，目前工业上主要采用外源乙烯处理来促进柑橘类水果的着色。然而，外源乙烯处理可能会导致果实着色变浅以及易受病害的影响。因此，有必要明确柑橘类水果着色过程中的关键因素，分析相关机制有助于开发新的脱绿技术。

柑橘类水果的着色色素主要是叶绿素和类胡萝卜素。在着色过程中，叶绿素的降解和类胡萝卜素的积累起着关键作用（Chen等人，2024年）。叶绿素主要由叶绿素a和叶绿素b组成，其存在掩盖了果皮中其他色素（如类胡萝卜素）的颜色，使果实呈现绿色。叶绿素的降解主要通过两条途径进行：一条是叶绿素a氧合酶（PAO）途径：叶绿素a在叶绿素酶和镁螯合合成酶（MCS）的作用下失去植醇基团和镁离子，形成最终的绿色叶绿素代谢物——叶绿素a甲酯；随后，去镁化的叶绿素a甲酯被PAO和红色叶绿素代谢物还原酶（RCCR）分解为多种荧光叶绿素代谢物（FCCs）；在酸性条件下，FCCs会转化为非荧光叶绿素产物（NCCs）（Hörtensteiner和Kräutler，2011年；Kräutler，2008年）。此外，叶绿素a还可以在基质绿蛋白（SGR）的催化下形成去镁化的叶绿素a（Matsuda等人，2016年）。另一条途径是氧化漂白：叶绿素对光敏感，在光胁迫下会产生大量活性氧（ROS），如单线态氧、超氧自由基和羟基自由基，这些ROS会损伤膜脂质分子、蛋白质和DNA结构，从而导致叶绿素降解（Li等人，2025a）。类胡萝卜素的生物合成途径主要遵循甲基erythritol磷酸（MEP）途径：PSY催化两个geranylgeranyl pyrophosphate（GGPP）分子的缩合生成植烯；植烯经过PDS和ZDS的一系列去饱和反应生成番茄红素（Du等人，2023年）。番茄红素是一种含有11个共轭双键的红色色素，其分子两端可通过番茄红素环化酶（LCY）发生环化反应：LCYB在番茄红素两端形成β-环，生成β-胡萝卜素；LCYE在一端形成ε-环，在另一端形成β-环，生成α-胡萝卜素；β-胡萝卜素和α-胡萝卜素进一步被羟化酶羟基化，形成各种氧化类胡萝卜素（xanthophylls）（Palombieri等人，2025年）。随着叶绿素的降解和类胡萝卜素的积累，果皮中色素化合物的比例发生变化，促使果实颜色从绿色转变为黄色。

温度是影响果实颜色形成和转变的关键环境因素，主要通过调控色素的生物合成、降解和代谢（如花青素、类胡萝卜素和叶绿素）来实现。在成熟的荔枝果实中，低温显著促进叶绿素的降解并促进花青素的积累，从而改善果实着色（Zou等人，2024年）。在番茄中，高温（38℃）会抑制颜色发育（包括类胡萝卜素的积累），但恢复到20℃后颜色发育恢复正常（Lurie等人，1996年）。在柑橘类水果的储存过程中，重庆地区果实颜色发育的最佳温度为24–25℃；在此温度条件下，果实着色加速，而低温和过高温度则会抑制柑橘类水果的着色（Ge等人，2022年）。

除了宏观层面的温度调控外，转录因子在基因水平上也对类胡萝卜素和叶绿素的代谢起着关键作用。研究表明，MYB、bHLH、NAC、WKRY和HSF等转录因子家族成员在果实着色调控中起重要作用。MYB家族转录因子作为花青素合成的主要正向调控因子，直接结合到结构基因启动子上以激活表达；在草莓中，FaMYB10的等位基因变异是果实颜色自然变异的主要原因，控制着果皮和果肉中的花青素分布（Loayza-Salazar等人，2024年）。bHLH家族转录因子与MYB形成异二聚体，增强MYB与目标基因的结合；在茄子中，SmbHLH39激活花青素结构基因SmCHS、SmANS和SmDFR的表达，并与SmMYB1形成MBW复合体，协同促进花青素的积累（Yu等人，2025年）。NAC家族转录因子整合激素和环境信号，调控果实成熟、叶绿素降解和类胡萝卜素的积累；在辣椒中，CaNAC2整合激素和表观遗传信号，直接激活CaCCS，促进果实着色（Song等人，2025年）。

热休克转录因子（HSFs）是一类在植物应对高温胁迫中起关键作用的转录因子。最新研究表明，它们在调控果实和蔬菜着色中起着重要作用，特别是在花青素和类胡萝卜素代谢途径中。在梨果实的研究中，发现20℃时，PpATL52（一种E3泛素连接酶）会降解PpHY5L（一种关键的光受体），解除其对PpHsfB2a的抑制，从而促进花青素合成基因的表达；35℃时，PpATL52的表达降低，导致PpHsfB2a蛋白积累，该蛋白直接结合到PpHY5L启动子上，抑制其表达，最终阻断花青素的合成（Wang等人，2025年）。类似地，在拟南芥中过表达南瓜热休克因子可增加叶绿素含量（Li等人，2025a）。通过对石榴三个发育阶段的转录组分析，发现HSFs是类胡萝卜素积累的潜在负调控因子（Wang等人，2024a）。在烟草中过表达甘薯LbHSF22可促进花青素的合成和积累（Chen等人，2026年）。然而，目前关于热休克转录因子对叶绿素和类胡萝卜素代谢影响的分子研究仍较为有限。

材料

从中国重庆北碚区采集的绿色成熟柑橘类水果，采后直接运输到实验室。选择大小均匀、成熟度一致、颜色均匀且无机械损伤的健康果实作为实验材料。用清水彻底冲洗后自然风干备用。第一批在不同温度下储存的柑橘类水果采集于2024年9月；第二批用于后续实验的柑橘类水果也采集于同年。

转录组数据分析

如图1所示，通过对研究组先前转录组数据（Ge等人，2022年）中差异表达的HSFs进行分析和筛选，在不同温度下储存的柑橘类水果中发现了CcHSFA3。在储存第6天，高温条件下CcHSFA3显著上调，导致果实保持绿色；而在室温条件下显著下调，导致果实呈现黄色。

不同储存温度对柑橘类水果果皮颜色的影响

不同储存温度下果皮颜色的变化如下所示

讨论

早熟柑橘类水果中果皮和果肉的异步成熟对其经济价值有显著影响，因此研究果皮着色调控机制至关重要。温度是影响果实颜色形成和转变的关键环境因素，主要通过调节与色素代谢相关的基因表达来实现（Zhu等人，2023年）

结论

本研究初步证实是HSF家族的典型转录因子，具有核膜共定位特性和转录激活活性。它可以抑制柑橘类水果采后的着色过程，直接结合到叶绿素合成的第一个限速酶上，加速叶绿素的生成；同时，它还与类胡萝卜素合成基因相互作用，降低其表达活性

作者贡献

邓莉莉构思并监督了整个项目；王丽蕾设计了实验；谢玉琳和彭乐萱完成了部分实验；王丽蕾分析了数据并撰写了论文；邓莉莉提供了建议并编辑了论文。所有作者都阅读并批准了最终版本。

CRediT作者贡献声明

谢玉琳：方法学、数据管理。彭乐萱：方法学、数据管理。王丽蕾：写作——初稿撰写、软件使用、方法学分析、数据管理。邓莉莉：写作——审稿与编辑、监督、资金争取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：32472404）的资助。