在人类健康与农业生产领域，寄生性线虫（如钩虫、鞭虫）的感染是一个持续存在的全球性挑战，影响着数十亿人口，尤其对贫困地区的儿童发育造成负面影响。与此同时，其他寄生线虫也对牲畜和农作物构成严重威胁。尽管现有药物和卫生条件的改善已在一定程度上控制了感染，但耐药性的出现使得新药开发迫在眉睫。当前可用的抗蠕虫药物作用靶点有限，因此，寻找新的、可成药的靶点成为了研究的关键。
在此背景下，一类名为I类环核苷酸磷酸二酯酶（Class I cyclic nucleotide phosphodiesterases, PDEs）的酶家族进入了研究者的视野。这些酶能够水解细胞内重要的第二信使分子——环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate, cAMP）和环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate, cGMP），从而调控广泛的生物学过程。在哺乳动物中，针对不同PDE家族的高效、高选择性抑制剂已被成功开发，证明了该靶点的“可成药性”。有趣的是，包括模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans, C. elegans）及其相关的寄生线虫在内，其基因组中也含有六个PDE基因，分属于哺乳动物11个PDE家族中的六个。这提示线虫的PDEs可能成为潜在的抗寄生虫药物新靶点。然而，一个关键问题在于：针对哺乳动物PDE设计的抑制剂，是否能同样有效地抑制线虫的同源PDE？此前有研究表明，线虫PDE-4对某些哺乳动物PDE4抑制剂并不敏感，这为直接“借用”现有药物带来了挑战。因此，开发专门针对线虫PDE的筛选平台和抑制剂工具箱，对于探索其治疗潜力和应对耐药性至关重要。
为了应对这一挑战，本研究团队创新性地利用了一种单细胞真核生物——裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）作为功能筛选平台。该酵母本身cAMP信号通路清晰，且关键蛋白激酶A（PKA）非必需，但可通过报告基因系统（如本研究中使用的fbp1-ura4报告系统）灵敏地反映细胞内cAMP水平的变化。具体而言，研究人员构建了一系列裂殖酵母工程菌株，这些菌株内源PDE活性缺失，但异源表达了来自C. elegans的全部六个PDE（PDE-1至PDE-6）或其催化结构域，以及来自三种寄生线虫（安哥拉管圆线虫Angiostrongylus costaricensis、毛首鞭形线虫Trichuris trichiura、马来布鲁线虫Brugia malayi）的PDE-4。通过一种基于5-氟乳清酸（5FOA）的生长实验，可以直观地检测PDE抑制活性：当化合物抑制了外源表达的PDE时，细胞内cAMP水平上升，激活报告基因，使酵母能够在含有5FOA的培养基中生长。利用这一平台，研究团队系统筛选了一个来源于前期针对哺乳动物PDE4、PDE7、PDE8和PDE11的高通量筛选所获得的小分子化合物库，旨在发现能有效抑制一种或多种线虫PDE的化合物。
主要技术方法概览：
本研究核心技术体系为基于裂殖酵母的异源表达与表型筛选平台。首先，通过分子克隆将线虫PDE基因整合至裂殖酵母基因组，构建稳定的工程菌株。核心筛选采用5FOA生长实验，该实验利用cAMP-PKA通路调控的报告基因，将PDE的抑制转化为酵母在选择性培养基中的生长优势，从而实现抑制剂的高通量、功能性鉴定。对筛选出的活性化合物，进一步在模式生物C. elegans（PE254品系）体内进行了定量高通量筛选（qHTS），通过高内涵成像分析评估化合物对线虫存活和繁殖的影响。同时，也采用了传统的液体培养暴露实验，通过视频分析手动计数评估线虫活力和生殖力。此外，还通过体外酶学实验测定了关键化合物对多种重组哺乳动物PDE的抑制活性，以评估其选择性。
研究结果：
3.1构建及优化表达线虫PDEs的S. pombe菌株**
成功构建并优化了表达各线虫PDE的裂殖酵母筛选菌株。通过调整菌株遗传背景（如缺失git3或gpa2以调控内源cAMP水平）、预培养cAMP浓度、5FOA浓度及接种细胞密度，使每个菌株在5FOA实验中都达到理想的动态范围，即无抑制剂时生长微弱，有效抑制剂存在时生长显著增强，为后续化合物筛选奠定了基础。
3.2人源PDE4B2与线虫PDE-4对罗利普兰的差异反应
实验证实，表达人PDE4B2的酵母菌株对经典PDE4抑制剂罗利普兰高度敏感，而表达C. elegans或三种寄生线虫PDE-4的菌株对罗利普兰的反应均很微弱甚至无反应。与此相反，化合物BC8–22对线虫PDE-4的抑制效果优于对人PDE4B2。序列比对发现，哺乳动物PDE4中一个关键苏氨酸残基（人PDE4B2的T407）在线虫PDE-4中对应位置为天冬酰胺（C. elegansPDE-4的N580）或缬氨酸。将C. elegansPDE-4的N580突变为苏氨酸（N580T）后，菌株对罗利普兰的敏感性显著恢复，表明该单氨基酸差异是导致线虫PDE-4对罗利普兰不敏感的主要原因。
3.3他达拉非在针对牛PDE5和C. elegansPDEs的5FOA生长实验中的效果**
他达拉非（Tadalafil）是一种PDE5抑制剂，曾有报道称其能减少寄生虫感染。本研究中，他达拉非在亚微摩尔浓度下即可有效抑制表达牛PDE5的酵母菌株，但对表达任何一种C. elegansPDE的菌株均无抑制活性（浓度高达50 µM）。这表明他达拉非此前报道的抗寄生虫效应可能并非通过抑制线虫PDE实现。
3.4针对C. elegansPDE1-PDE6的化合物分析**
利用5FOA实验对7个先导化合物进行了抑制谱分析。结果显示，大多数化合物对多种线虫PDE有抑制活性，但选择性有限。其中，BC8–22是除PDE-4外对其他五种C. elegansPDE最有效的广谱抑制剂。化合物BC75显示出对C. elegansPDE-4较好的选择性抑制。
3.5PDE抑制剂对C. elegans生长和繁殖力的影响**
通过C. elegans体内qHTS和传统液体培养实验评估了化合物的生物学效应。BC8–22和BC11–25在低微摩尔浓度下即显示出毒性，能显著降低线虫的存活率。在生殖力测试中，BC8–22、BC11–25以及BC37均能显著降低子代与亲代的比例，即影响线虫的繁殖能力。而5FOA实验中有效的BC8–20在线虫体内实验中未显示出毒性。
3.6BC8–22对哺乳动物PDEs的活性
鉴于BC8–22对多种线虫PDE有抑制活性，研究进一步测试了其对10个哺乳动物PDE家族的抑制情况。体外酶活实验表明，即使在200 µM的高浓度下，BC8–22对大多数测试的哺乳动物PDE抑制率也有限（对PDE10抑制约60%），表明其对线虫PDE的抑制活性与其对哺乳动物PDE的抑制谱并不完全重叠。
研究结论与意义：
本研究成功建立并验证了基于裂殖酵母的功能性平台，用于发现和表征针对线虫PDE的新型抑制剂。研究明确了线虫PDE-4对经典PDE4抑制剂（如罗利普兰）敏感性低的分子基础在于关键活性位点氨基酸（如N580）的差异，这解释了为何针对人源PDE4设计的药物难以直接用于抗线虫感染。通过筛选，鉴定出如BC8–22等能有效抑制多种线虫PDE并在体内对C. elegans产生毒性、影响其繁殖力的化合物，为后续抗蠕虫药物研发提供了有价值的先导分子。
更重要的是，该研究策略具有广泛的普适性。它不仅适用于线虫，也为针对其他表达更少PDE、可能更易成药的寄生虫（如疟原虫Plasmodium falciparum、巴贝斯虫Babesia、贾第鞭毛虫Giardia lamblia）的药物发现提供了创新路径。通过直接从针对寄生虫PDE的高通量筛选中发现先导化合物，而非依赖对哺乳动物PDE抑制剂的改造，有望开发出选择性更高、副作用更小的新型抗寄生虫药物，从而应对日益严峻的寄生虫病挑战和耐药性问题。这项研究发表于《Cellular Signalling》期刊，为寄生虫药物靶点发现和筛选技术提供了重要的方法论和实证支持。
