虹鳟（Oncorhynchus mykiss）中IHNV G蛋白潜在毒力位点的鉴定及其对IHNV致病性和免疫原性的影响

本研究的中文摘要：比较J型传染性造血器官坏死病毒（IHNV）与其他基因型G蛋白序列差异，发现5个关键氨基酸位点（G67E、I107T、E124K、G221A、G256Q）。通过反向遗传学构建重组病毒，证实突变107和124显著降低毒力，其中rIHNV-G107诱导快速IgM应答和87.5%的保护率，并激活IL-1β、TLR3等先天免疫基因。

吴光清|敖瑞|马玉露|史彦雪|关雪婷|徐建国|吕新佳|刘敏

中国东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨150030

摘要

传染性造血坏死病毒（IHNV）是导致鲑科鱼类急性出血性疾病的主要病原体，给全球渔业带来了巨大的经济损失。该病毒的糖蛋白（G蛋白）含有调节毒力和免疫原性的关键决定因子，因此是疫苗开发的重要靶点。

在本研究中，我们将J基因型的IHNV的G蛋白序列与其他基因型的G蛋白序列进行了比较，以识别可能与毒力差异相关的氨基酸残基。利用反向遗传学技术恢复了携带特定突变的重组病毒，共获得了五种重组病毒，分别命名为rIHNV-G₆₇、rIHNV-G₁₀₇、rIHNV-G₁₂₄、rIHNV-G₂₂₁和rIHNV-G₂₅₆。为了确定这些潜在毒力相关位点的功能，我们进行了致病性和免疫原性实验。结果显示，G蛋白第107位和第124位的突变显著降低了病毒的毒力。感染rIHNV-G₁₀₇和rIHNV-G₁₂₄的虹鳟鱼累积存活率分别为74%和35%，远高于感染亲本株rIHNV HLJ-09或野生型IHNV HLJ-09的鱼类。与感染wtIHNV HLJ-09的鱼类相比，感染rIHNV-G₁₀₇和rIHNV-G₁₂₄的虹鳟鱼体内与先天免疫相关的基因（如IL-1β和TLR3）表达显著上调。血清学分析表明，接种rIHNV-G₁₀₇的鱼类比接种wtIHNV HLJ-09的鱼类更早产生特异性血清IgM抗体。这些发现表明G₁₀₇突变增强了抗原呈递并加速了免疫反应。此外，接种rIHNV-G₁₀₇的虹鳟鱼对IHNV具有很强的保护作用，相对存活率（RPS）达到约87.50%，高于其他重组病毒株。总体而言，这些结果表明G蛋白的第107位和第124位氨基酸残基在IHNV的毒力和免疫原性中起着关键作用。

引言

传染性造血坏死（IHN）是一种由传染性造血坏死病毒（IHNV）引起的鲑科鱼类急性病毒性疾病，可在易感物种中导致高达100%的死亡率[1] [2]。世界动物卫生组织（WOAH，前称OIE）将IHN列为需报告的疾病。在中国，它被归类为II类动物疫病。

随着全球贸易和水产养殖业的迅速发展，IHN已传播到世界许多地区，成为鲑鱼和鳟鱼养殖业可持续发展的主要威胁。IHNV是一种子弹形状的包膜病毒，直径约为60-80纳米，长度约为160-180纳米。其基因组为非分段的负链单链RNA[3]。该病毒编码六种主要蛋白质：糖蛋白（G）、核衣壳蛋白（N）、RNA依赖性RNA聚合酶（L）、基质蛋白（M）、磷酸蛋白（P）和一种独特的非结构蛋白（NV）[4]。根据G基因的序列变异，IHNV被分为五种主要基因型：U、L、M、E和J[5]。值得注意的是，迄今为止在中国报告的所有IHNV分离株都属于J基因型[6]。因此，开发针对J基因型的疫苗对于控制中国的IHNV具有实际意义。

活减毒疫苗是利用经过人工减毒或自然减毒的病原微生物制备的，使其成为低毒力或无毒力的菌株。接种后，这些疫苗能引发强烈的细胞免疫反应并持续产生中和抗体。活减毒疫苗已在哺乳动物系统中得到广泛研究和应用，而针对水生动物病毒的疫苗研发仍处于早期阶段。目前，生产减毒IHNV菌株的主要策略包括在易感细胞系中连续传代以降低毒力，使用中和单克隆抗体筛选减毒突变体，以及通过反向遗传技术进行基因敲除、替换或重排来恢复重组病毒。值得注意的是，利用抗IHNV中和单克隆抗体成功分离出了两种减毒IHNV突变体RB-1和193-110-4。当虹鳟鱼接种这两种菌株14天后，后续攻击实验显示RB-1的相对免疫保护率（RIPR）为56%-95%，而193-110-4的RIPR更高，达到83%-100%[7]。另一种减毒IHNV菌株是通过连续细胞传代获得的。接种该菌株的虹鳟鱼在免疫后120天时，血清中和抗体滴度达到1280；免疫后12个月，存活率为81%，抗体滴度中位数为160[8]。通过反向遗传学技术，通过特异性替换核衣壳（N）蛋白中的第85位和第102位氨基酸，获得了减毒菌株rIHNV-N₈₅和rIHNV-N₁₀₂。致病性测试显示，这些重组菌株的累积存活率分别为52.5%和55%，免疫保护率分别为60%和55%[9]。此外，通过G蛋白中N-糖基化位点的定向突变，还获得了减毒菌株rIHNV-N438A[10]。基于此菌株，构建了一种重组双价减毒病毒rIHNV-N438A-ΔNV-VP2，该病毒对野生型IHNV和传染性胰腺坏死病毒（IPNV）的Sp血清型具有双重保护作用，保护率分别为84.6%和88.9%[6]。

IHNV的G蛋白位于病毒包膜上。其在病毒表面的特定分布使其能够结合宿主细胞受体，这一过程与病毒吸附和侵入宿主细胞有关。值得注意的是，G蛋白包含IHNV的主要抗原决定因子，可诱导宿主产生病毒特异性中和抗体，并作为刺激宿主强烈免疫反应的核心蛋白[11]。因此，G蛋白是研究IHNV毒力位点的重要靶点。最新研究表明，副粘病毒胞外域中特定氨基酸的替换可以改变其毒力。具体而言，IHNV RB-1菌株中G蛋白第78位和第218位的突变可显著降低病毒毒力[12]。组织学分析显示，感染RB-1菌株的鱼类与感染其他IHNV分离株和野生型菌株的鱼类相比，病毒抗原的分布模式存在明显差异。这表明G蛋白突变可能同时调节IHNV的毒力和组织趋向性。Jia等人证明，IHNV G蛋白第438位的突变会降低病毒致病性，并推测该位置的糖基化可能与病毒的免疫逃逸机制有关[10]。因此，进一步鉴定G蛋白中的其他毒力相关位点对于开发低毒力且具有强免疫原性的活减毒IHNV疫苗至关重要。

尽管先前的研究已经确定了IHNV G蛋白中的毒力相关残基（如第78位、第218位[12]和第438位的N-糖基化位点[10]），但这些残基与在中国普遍存在的J基因型的相关性尚不清楚，其潜在机制也尚未完全阐明。这些已报道的位点主要与免疫逃逸或受体结合有关，而J基因型特有的毒力决定因子尚未被表征。

在本研究中，通过对J基因型IHNV与其他基因型减毒菌株的基因组比较，发现了五种保守的氨基酸替换（G67E、I107T、E124K、G221A、G256Q），这些替换与先前报道的位点不同。利用反向遗传学技术，我们恢复了携带这些突变的重组病毒，并评估了它们在虹鳟鱼中的致病性和免疫原性。结果表明，第107位和第124位的突变显著降低了病毒毒力，同时增强了免疫原性。特别是rIHNV-G₁₀₇引发了更早且更强的IgM反应，并提供了更强的保护效果（RPS = 87.5%）。这些发现揭示了IHNV G蛋白中的两个新的毒力决定因子，为针对中国水产养殖中普遍存在的J基因型开发减毒疫苗提供了有希望的候选株。

在本研究中，我们利用反向遗传技术在糖蛋白（G蛋白）的特定氨基酸残基引入了定向突变，生成了五种用于虹鳟鱼的重组传染性造血坏死病毒（rIHNVs）。通过系统评估G蛋白在病毒致病性中的作用，我们确定了决定毒力的关键氨基酸位点并表征了它们的免疫原性特性。这些结果揭示了特定G蛋白残基如何调节IHNV的毒力，为了解重组弹状病毒的病毒学机制提供了新的见解。重要的是，这些结果为开发有效的IHNV预防和控制策略提供了关键指导，同时也为揭示病毒致病机制和推进疫苗研发提供了宝贵参考。

细胞、质粒、病毒、抗体和鱼类

大规模鲑鱼胚胎细胞系（CHSE-214）来自美国典型培养物保藏中心（ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯），并在添加了10%胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，中国）的L-15培养基中于22°C条件下培养。质粒pBlueScript II SK-F543216、pMD18-T-F_2-3和pCI-IHNV HLJ-09（含有完整的IHNV基因组）以及我们在实验室构建的pCI-G、pCI-N、pCI-P、pCI-L和pCI-NV储存在-80°C下。野生型IHNV HLJ-09菌株

rIHNV的鉴定

在本研究中，我们比较了J基因型IHNV G蛋白中潜在的毒力相关位点（D/N67E、I107T、E124K、G221A、G256Q）。利用反向遗传学技术，我们成功构建了重组质粒（pCI-G67、pCI-G107、pCI-G124、pCI-G221和pCI-G256），并将它们与辅助质粒系统一起转染到CHSE-214细胞中。转染后的前7天内，这些重组病毒均未引起明显的细胞毒性。然而，在连续传代5次后

讨论

不同基因型的IHNV菌株在虹鳟鱼中的毒力表现不同。一些研究表明，感染J基因型IHNV菌株（RtPc0314g、RtPc0314c、HLJ-09、RtShiz06s和RtShiz06a）的虹鳟鱼死亡率在60%到100%之间[16] [17]。相比之下，感染M基因型、U基因型或L基因型IHNV菌株的虹鳟鱼死亡率分别为25%-85%、0%-25%和5%-10%[18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26]。因此，J基因型

结论

在本研究中，我们利用反向遗传技术成功恢复了五种重组病毒rIHNV-G₆₇、rIHNV-G₁₀₇、rIHNV-G₁₂₄、rIHNV-G₂₂₁和rIHNV-G₂₅₆。这些重组菌株的体外生长动力学与野生型菌株wtIHNV-HLJ09相当。接种rIHNV-G₁₀₇的虹鳟鱼对IHNV攻击表现出显著的保护效果，相对存活率（RPS）约为87.5%。rIHNV-G₁₀₇菌株还诱导了更高的

CRediT作者贡献声明

吴光清：撰写——原始草稿、方法学、研究、概念构思。敖瑞：研究、数据整理。马玉露：形式分析。吕新佳：撰写——审稿与编辑。刘敏：撰写——审稿与编辑、资金获取、概念构思。

数据可用性

数据可应要求提供。

伦理批准和参与同意

本实验室动物伦理研究已获得东北农业大学实验室动物福利伦理委员会的批准。批准编号：NEAUEC20240239

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（Grant No. 32503234, 32173012）和青岛海洋科学与技术国家重点实验室前沿技术自由探索项目——鱼类mRNA疫苗关键技术研究（Grant No. 81016300）的资助。中国博士后科学基金（Grant No. 2025MD774055）。东北农业大学的人才引进计划（Grant No. 54961312）也提供了资金支持。