作者：Rele Gauri Shrikant、V.S. Chouhan、Chinmay Warghat、Poonam Yadav、Shweta Sharma、H.A. Samad、Brijesh Kumar、V.P. Maurya、Gyanendra Singh
印度北方邦Izatnagar的ICAR-印度兽医研究所生理学与气候学部门，邮编243122
摘要
α-酮戊二酸（AKG）是三羧酸循环中的关键代谢物，具有显著的抗氧化特性，能够减轻氧化应激。虽然已有研究表明其在猪、小鼠和绵羊卵母细胞体外成熟（IVM）中的益处，但其在牛卵母细胞中的作用——尤其是通过卵子采集（OPU）获得的卵母细胞——尚未得到研究。本研究首次使用来自Sahiwal牛（Bos indicus）的OPU获得的卵母细胞，测试了15 µM、30 µM和45 µM浓度的AKG对IVM的影响。主要评估的参数包括卵母细胞成熟率、 cumulus细胞扩张情况、细胞内谷胱甘肽（GSH）和活性氧（ROS）的水平，以及与氧化应激（NRF2基因）、凋亡（BAX、BCL2基因）和成熟相关（BMP15、GDF9基因）的表达。结果表明，30 µM浓度的AKG显著增强了卵母细胞的成熟（77.77% vs 56.09%，P < 0.05），降低了ROS水平（27.96 ± 4.388 vs 49.01 ± 1.870，P < 0.01），并增加了GSH的积累（25.01 ± 0.8467 vs 17.99 ± 1.586，P < 0.001）。对去膜卵母细胞的基因表达分析显示，30 µM组中GDF9、BCL2和NRF2基因的表达显著上调，表明其有助于改善卵母细胞的成熟、调节凋亡并减少氧化应激。这些发现强调了优化AKG在IVM方案中的潜力，以提高牛繁殖技术中卵母细胞的质量和发育能力。
引言
全球食品需求的增加和动物蛋白成本的上升推动了畜牧遗传学的进步，促进了先进繁殖技术（如胚胎生产）的广泛应用。尽管亚洲拥有庞大的牛群，但在每10,000头牛的胚胎产量方面，该地区仍落后于世界其他地区[1]。奶牛的遗传改良率为2.5–8.0%，而IVP技术有可能将这一比率提高三到四倍，尤其是在通常只产一胎的牛种中[2]。目前，用于IVF的未成熟卵母细胞中只有30%能发育到囊胚阶段，仅有12%能成功出生[3]。
卵母细胞的成熟是体外生产（IVP）系统中的第一个也是最重要的限制步骤，随后是体外受精（IVF）和体外培养（IVC）。提高IVP效率的努力主要集中在改进体外成熟（IVM）过程上，这对建立卵母细胞的发育能力至关重要[3]。卵母细胞在IVM过程中逐渐获得发育潜力，这一过程一直持续到受精时胚胎基因组被激活[4]。然而，在体外培养的卵母细胞经常面临各种细胞压力，这增加了其失去发育能力的风险，相比体内获得的卵母细胞而言[5]。提高IVM效率的主要障碍是氧化应激，它会对卵母细胞成熟和胚胎发育产生负面影响[6],[48]。在IVM过程中，由于暴露于可见光、污染物以及IVM培养基中的特定成分等因素，会产生活性氧（ROS），包括羟基自由基、过氧化氢和超氧阴离子[7],[8]。体外环境中的高氧浓度会导致ROS水平升高，从而引发染色体异常、细胞器功能障碍、纺锤体异常、DNA片段化和卵母细胞凋亡[9]。
抗氧化剂在减轻氧化应激方面起着关键作用，它们通过保护卵母细胞免受ROS的损害来发挥作用。抗氧化酶有助于中和氧的毒性，在生物体内以微量存在，对维持细胞完整性至关重要[10]。然而，IVM培养基通常缺乏体内环境中存在的抗氧化酶，例如输卵管和卵泡液中的抗氧化酶[11]。因此，建议在IVM过程中补充抗氧化剂以促进卵母细胞成熟和胚胎发育。适当的抗氧化剂浓度可以显著改善卵母细胞的质量、细胞分裂和成熟[12]。通过直接降低ROS水平或增加谷胱甘肽（GSH）水平，抗氧化剂补充有助于缓解IVM过程中的氧化应激[13]。
最近的研究探索了使用各种抗氧化剂来促进体外卵母细胞成熟的方法。研究表明，褪黑素[13]和辅酶Q10[14]等化合物可以通过维持细胞内的氧化还原平衡来提高卵母细胞的质量。其他用于IVM的抗氧化剂包括硫醇类、多酚类化合物、类胡萝卜素、维生素C和E以及白藜芦醇[13],[15]。其中，α-酮戊二酸（AKG）作为一种关键的抗氧化剂和代谢中间体，显示出改善卵母细胞质量的潜力。AKG参与能量代谢、信号传导和抗氧化防御，在降低ROS水平和维持细胞功能方面起着关键作用[16],[17],[18],[19]。AKG可以清除自由基并增强线粒体功能，从而改善卵母细胞成熟和胚胎发育[20]。此外，AKG还能延缓与衰老相关的生殖潜力下降[21]。AKG的抗氧化作用是通过其与活性分子（如过氧化氢）相互作用实现的，将其转化为琥珀酸的同时释放ATP[22]。这种抗氧化作用表明，AKG可以通过减少氧化应激和凋亡来提高卵母细胞和胚胎的发育能力。研究还显示，AKG补充可以增加卵泡数量并改善卵母细胞质量，特别是在IVM过程中，通过促进极体释放和增加囊胚形成[23]。
AKG对Keap1-NRF2信号通路的影响，该通路是调节机体抗氧化反应的关键系统，可能进一步阐明其对卵母细胞和胚胎发育的有益作用。NRF2通路的激活促进了参与抗氧化防御和细胞保护的下游基因的表达。最新研究表明，AKG补充可以增加囊胚中的NRF2表达，表明AKG可能增强卵母细胞和胚胎对氧化应激的抵抗力[24]。然而，AKG在调节NRF2通路及其对牛胚胎发育和存活率的影响仍需进一步研究。
鉴于AKG作为抗氧化剂在减轻体外卵母细胞成熟过程中氧化应激方面的潜力，本研究假设AKG补充将提高牛卵母细胞的质量和成熟度。本研究的主要目的是评估不同浓度的AKG对体外培养的牛卵母细胞成熟度、相对ROS水平和谷胱甘肽水平以及相对基因表达的影响。通过深入理解AKG缓解氧化应激的潜力，本研究旨在为提高牛的体外受精（IVF）和胚胎生产的效率和成功率提供有价值的见解。
操作步骤片段
卵子采集程序（OPU）
首先用清水冲洗外阴和会阴区域，然后用消毒纸巾清洁并擦干。通过注射3–5 mL的2%盐酸利多卡因进行尾部硬膜外麻醉，以防止排便和腹部用力，并便于通过直肠操作卵巢。OPU（卵子采集）程序的参数如下：使用18 G的一次性吸针，流速为15 mL/min，并保持真空压力
成熟率和极体释放
对照组（N=41，成熟率为56.18 ± 2.806）与30 µM AKG组（N=45，成熟率为77.82 ± 1.734）之间存在显著差异（p < 0.05）。如图2 A所示，30 µM AKG组的成熟率最高，达到77.77%，而对照组的成熟率为56.09%。15 µM AKG组（N=47，成熟率为65.13 ± 4.613）略高，45 µM AKG组的数据未提供
讨论
α-酮戊二酸（AKG）是三羧酸循环中的关键中间体，最近因其潜在的抗衰老特性和增强线粒体健康的作用而受到关注[26],[27],[28],[29],[30]。多项研究表明，AKG对多种物种的体外卵母细胞成熟有积极影响，包括猪（20 µM）、小鼠（150 µM）、绵羊（3 mM二甲基-AKG）和牛（30 µM）模型。然而，关于AKG对
结论
α-酮戊二酸（30 µM）可提高卵母细胞的成熟率，降低活性氧（ROS）水平并增加谷胱甘肽水平，表明其有助于减轻氧化应激并保护牛卵母细胞免受其有害影响。此外，GDF9基因的表达显著上调，支持了成熟率的提高。α-酮戊二酸还上调了抗凋亡基因BCL2和抗氧化基因NRF2的表达，进一步证实了其
伦理批准
本研究是“利用MOET和OPU-IVF-ET平台生产优质胚胎和优秀犊牛”的项目的一部分，该项目编号为IAEC/26.07.2021/B5。
作者贡献声明
Rele Gauri Shrikant和V.S. Chouhan：负责写作、审稿和编辑；Brijesh Kumar：负责方法学和实验设计；V.S. Chouhan：负责资金筹集；Chinmay Warghat：负责数据分析、概念构思；VP. Maurya和Gyanendra Singh：负责监督、方法学指导；Poonam Yadav、Shweta Sharma和H.A. Samad：负责实验设计和数据分析、概念构思。
致谢
我们感谢印度Izatnagar的ICAR-印度兽医研究所所长对这项研究的资助。
