李亚彤|周志彦|栾梦音|梁超然|陈琳|龚子彤|张欣|沈志恩|王强|王晓英
山东大学齐鲁医学院口腔学院与医院牙髓病学系，山东省口腔组织再生重点实验室，山东省牙科材料与口腔组织再生工程技术研究中心，山东省口腔疾病临床研究中心，济南，250012，中国
摘要
目的
恢复神经支配对于功能性牙髓再生至关重要。Apelin是一种内源性生物活性肽，在神经系统中广泛表达，据报道具有促进神经保护和神经分化的作用。本研究旨在探讨Apelin-13在促进人类牙髓干细胞（hDPSCs）神经分化中的作用，并阐明其背后的分子机制。
材料与方法
为了探索Apelin在牙髓神经支配过程中的作用，研究了小鼠牙髓中Apelin的表达模式。分离并表征了hDPSCs，并对其进行了神经诱导处理。为了研究Apelin-13的功能，用重组Apelin-13蛋白处理hDPSCs，并转染Apelin特异性siRNA。为了确定Apelin-13诱导的神经分化是否依赖于APJ信号通路以及是否涉及Wnt/β-连环蛋白信号通路，通过siRNA沉默APJ，并用Dickkopf-1抑制该通路。采用qRT-PCR、Western blot和免疫荧光技术检测神经标志物和关键信号通路分子的表达情况。
主要发现
在小鼠第一磨牙牙髓发育过程中，内源性Apelin和Nestin在时间和空间上共表达，表明Apelin可能在神经调节中发挥作用。Apelin-13显著促进了hDPSCs的体外神经分化，而Apelin敲低则抑制了这一过程。机制上，Apelin-13以APJ依赖的方式诱导hDPSCs的神经分化，并同时激活了Wnt/β-连环蛋白信号通路。
意义
Apelin-13通过激活Wnt/β-连环蛋白信号通路，以APJ依赖的方式促进hDPSCs的神经分化。
引言
龋齿是一种影响所有年龄段的常见口腔疾病[1] [2]。如果不加以治疗，它可能会扩散到牙髓，导致牙髓炎、根尖周牙周炎等并发症。由于牙髓组织结构封闭且复杂，其自我修复能力有限。目前，根管治疗是牙髓疾病的标准临床方法[3]。尽管根管治疗能有效消除感染，但会去除牙髓，从而影响其重要的生理功能，如营养供应、感觉传导、免疫防御和再生潜力[4]。再生性牙髓治疗旨在通过组织工程技术恢复牙髓的结构完整性和生物功能，这依赖于四个关键组成部分：干细胞、生物活性分子、支架材料和递送系统[5] [6]。根据美国牙髓病学会的规定，再生性牙髓治疗的最终目标是使牙髓活力测试呈现阳性结果，表明牙髓功能得到恢复[7]。然而，先前的研究表明，仅有约60%的年轻恒牙在血管重建术后牙髓活力测试中表现出阳性反应[8]。因此，实现完全的牙髓再生，特别是一致且具有功能的神经再生，仍然是一个重大的生物学和技术挑战[9]。最近，体外细胞归巢策略在牙髓组织工程中受到了越来越多的关注。通过将FGF-2、VEGF、NGF和PDGF等生长因子引入根管系统，这些方法旨在招募内源性细胞，促进其迁移、分化和再生能力，从而显示出临床应用的巨大潜力[10] [11] [12]。
Apelin是一种由X染色体上的APLN基因编码的内源性生物活性肽[13]。其受体APJ属于G蛋白偶联受体（GPCR）家族，在多种组织中广泛表达[14] [15]。研究表明，Apelin/APJ信号轴具有神经保护作用，并能促进多种神经系统疾病中的细胞分化[16] [17]。Apelin首先以前体形式合成，随后被加工成几种生物活性片段，包括Apelin-13、Apelin-17和Apelin-36，这些片段在肽长度上有所不同，但保留了C末端核心序列[13]。其中，Apelin-13与神经调节过程密切相关，使其成为体外研究的理想候选肽[18] [19]。然而，迄今为止，尚未有研究探讨Apelin-13对人类牙髓干细胞（hDPSCs）神经分化的影响及其背后的分子机制。基于此，本研究旨在阐明Apelin-13在促进hDPSCs神经分化中的作用和机制。我们的体内实验表明，在小鼠第一磨牙发育过程中，Apelin和神经标志物Nestin在时间和空间上共表达，提示Apelin可能参与牙髓神经的发育。基于这一发现，我们进一步研究了Apelin-13在hDPSCs神经分化中的潜在作用及其相关分子机制。
鉴于APJ是Apelin的特异性受体，并参与介导Apelin/APJ轴的生物学效应，我们首先探讨了Apelin-13对hDPSCs的促神经发生作用是否依赖于APJ。由于Wnt/β-连环蛋白信号通路是公认的神经分化调节因子[20] [21] [22]，且先前的研究显示Apelin-13缺乏会抑制小鼠中的Wnt/β-连环蛋白信号通路[23]，我们进一步研究了Wnt/β-连环蛋白通路是否参与Apelin-13诱导的hDPSCs神经分化。
动物实验
所有动物实验均遵循ARRIVE指南进行，并获得了山东大学口腔医院伦理委员会的批准（批准编号20230902）。实验动物来自山东大学实验动物中心，使用的昆明小鼠为无特定病原体动物。小鼠不分性别，因此未进行性别分组或分析。小鼠的饲养和繁殖比例为雌雄2:1。在出生后（P）第5天、第7天...
小鼠下颌第一磨牙牙髓神经发育过程中Apelin的时空表达
为了研究小鼠下颌第一磨牙牙髓神经发育过程中Apelin的表达模式，本研究采用了HE染色和以Nestin为参考神经标志物的免疫荧光技术。结果表明，在P5（图1A）、P7（图1B）、P14（图1C）和P30（图1D）阶段，Nestin和Apelin在成牙本质细胞层中持续共表达。此外，在成釉细胞、牙乳头、Hertwig上皮根鞘中也检测到了弱信号...
讨论
Apelin在多种组织中广泛分布，并在心血管系统、骨骼系统和神经系统等多个系统中发挥多种生物学功能。研究表明，Apelin能促进骨髓干细胞的成骨分化，增强骨再生能力，包括恢复卵巢切除小鼠模型中的骨结构、防止骨丢失以及加速胫骨缺损模型中的骨折愈合[25]。在神经系统中，Apelin-13表现出显著的作用...
结论
Apelin-13以APJ依赖的方式促进hDPSCs的神经分化，并伴随Wnt/β-连环蛋白通路的激活。这些发现为再生性牙髓治疗中增强牙髓神经再生的策略提供了机制支持，可能有助于改善牙髓保存的效果。
缩写
- APJ
- 与血管紧张素II型1受体相关的假定受体蛋白
- βIII-Tubulin
- βIII型微管蛋白
- BSA
- 牛血清白蛋白
- bFGF
- 基本成纤维细胞生长因子
- Co-IP
- 共免疫沉淀
- DKK1
- Dickkopf-1
- EDTA
- 乙二胺四乙酸
- EGF
- 表皮生长因子
- FBS
- 胎牛血清
- GPCR
- G蛋白偶联受体
- hDPSCs
- 人类牙髓干细胞
- HE染色
- 苏木精和伊红染色
- NSE
- 神经元特异性烯醇化酶
- N-A
- Neurobasal-A培养基
| PBS |
- 磷酸盐缓冲盐水
| P |
- 出生后
| PVDF |
- 聚偏二氟乙烯
CRediT作者贡献声明
李亚彤：撰写——原始稿件、可视化、验证、项目管理、方法学、实验设计、数据分析、概念化。
周志彦：撰写——审阅与编辑、可视化、方法学、资金获取。
栾梦音：可视化、方法学、数据管理。
梁超然：撰写——审阅与编辑、方法学、概念化。
陈琳：撰写——审阅与编辑。
龚子彤：撰写——审阅与编辑。
张欣：撰写——审阅与...
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了山东省自然科学基金（项目编号ZR2019MH014和ZR2023QH447）、济南市卫生健康委员会科技计划项目（项目编号2021-1-42）以及2022年院长研究资助项目（项目编号2022-02）的支持。这些资助方未参与研究设计、数据收集、分析或手稿撰写。
