王斌瀚|郝颖|洪伟琪|白子仪|秦芙蓉|艾家元|刘健|阿卢·阿克|高子睿|吴一鸣|周英琼|林毅|黄宇鹤|敖丹怡|姜玉杰|魏玉泉|田晓禾|魏华夏
中国四川大学华西医院国家老年医学临床研究中心生物治疗国家重点实验室衰老研究与癌症药物靶点实验室
摘要
mRNA疫苗在针对传染性疾病和癌症的免疫治疗中取得了显著进展，其中脂质纳米颗粒（LNPs）作为递送系统发挥了关键作用。尽管LNPs能有效提高mRNA的稳定性和细胞摄取效率，但其免疫调节效应仍不完全清楚。本研究证明，LNPs的给药会通过引发全身性炎症反应促进肿瘤转移。在小鼠模型中，LNPs注射导致肺部急性中性粒细胞聚集，这一现象是由注射部位坏死肌肉细胞释放的线粒体DNA（mtDNA）引发的。mtDNA介导的信号通路激活了TLR9-MyD88和cGAS-STING通路，进而形成了中性粒细胞胞外陷阱（NETs），为肿瘤转移创造了有利环境。这些发现强调了需要改进LNPs的配方，以减轻不必要的免疫激活同时保持其作为疫苗载体的有效性。随着基于mRNA的疗法从传染性疾病扩展到肿瘤学领域，合理设计的LNPs可能提供更安全、更有效的递送平台。
引言
mRNA疫苗已成为传染病预防和癌症免疫治疗的革命性平台。辉瑞-BioNTech（BNT162b2）和Moderna（mRNA-1273）的COVID-19疫苗证明了脂质纳米颗粒（LNPs）作为高效载体的可行性，因此获得了美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）的批准[1][2][3][4]。除了传染性疾病，基于LNPs的mRNA疗法目前正在探索用于癌症治疗和其他医疗应用[5][6][7][8]。
mRNA疫苗的一个显著特点是使用可电离的阳离子LNPs来封装和递送mRNA至目标细胞[9][10][11]。这些纳米颗粒不仅保护mRNA免受降解，还能主动刺激免疫反应[12][13]。作为疫苗佐剂，LNPs在注射部位引发局部炎症，表现为白细胞浸润和细胞因子释放，从而增强抗原呈递和免疫原性[14]。然而，新的证据表明，LNPs引发的免疫激活也可能导致不必要的炎症效应[4][15][16]。虽然大多数报告的不良反应（如注射部位疼痛、疲劳和肌痛）是暂时的[17][18]，但持续的炎症可能会引发全身性免疫失调。
炎症与肿瘤发生之间的相互作用非常复杂，自19世纪以来一直受到广泛研究。炎症的主要介质是中性粒细胞，它们在局部炎症中产生，并且具有从循环系统渗透到多种组织的能力[19]。因此，中性粒细胞在肿瘤转移过程中的作用正在被深入研究[20][21]。已有研究表明，中性粒细胞活化时释放的颗粒蛋白（如基质金属蛋白酶9（MMP9），可促进血管生成并帮助肿瘤细胞外渗；而精氨酸酶-1则能创建抑制免疫的微环境[23]。此外，在中性粒细胞群体（N1型和N2型）中，有证据表明N2型中性粒细胞通过产生促转移蛋白（如IL-1β）以及促进肿瘤血管生成和重塑细胞外基质（ECM）来促进肿瘤转移微环境的形成[24][25]。中性粒细胞还能释放颗粒蛋白和降解的染色质，形成包含组蛋白、颗粒蛋白和细胞质蛋白的中性粒细胞胞外陷阱（NETs）[26][27][28][29]。NETs中的中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）能与层粘连蛋白结合，其水解层粘连蛋白会暴露出一个表位，通过整合素激活和FAK/ERK/MLCK/YAP信号通路增强肿瘤细胞的转移潜力[30]。尽管关于炎症在肿瘤发生和肿瘤发展中的作用已有大量深入研究，但目前对于疫苗接种引起的局部炎症与肿瘤之间的关联仍知之甚少。
在本研究中，我们发现肌肉内注射LNPs会导致局部肌肉细胞坏死，释放线粒体DNA（mtDNA）进入血液循环，形成损伤相关分子模式（DAMP）。循环中的mtDNA通过TLR9-MyD88和cGAS-STING通路激活中性粒细胞[31][32]，导致它们在肺部聚集并形成促转移微环境。重要的是，关键信号成分的基因敲除（Tlr9⁻/⁻、MyD88⁻/⁻、Sting⁻/⁻）消除了这种效应，证实了LNPs诱导的炎症在转移中的因果作用。虽然之前的研究强调了LNPs的免疫刺激特性，但我们的发现表明其影响超出了传统疫苗佐剂的范畴，可能对癌症进展产生影响。我们不将其视为“副作用”，而是认为这是设计和应用mRNA-LNP疗法时需要重点考虑的因素。
章节摘录
可电离阳离子纳米载体的制备与表征
根据之前报道的mRNA疫苗中LNPs脂质相各组分的比例（图1a-b）[4]，我们使用微流控技术合成LNPs，并将所得液体透析过夜。透射电子显微镜（TEM）显示LNPs主要呈椭圆形，显微图像直接展示了其大小（图1c）。此外，我们还通过测量颗粒大小对其进行了表征，得到平均直径
讨论
炎症在癌症进展中起着关键作用，它促进侵袭、上皮-间充质转化（EMT）和肿瘤细胞迁移[50][51][52]。作为mRNA疫苗递送系统的脂质纳米颗粒（LNPs）已知会引发显著的炎症反应。单独接触LNPs即可引发炎症，放大现有的免疫反应，甚至导致适应性免疫的长期抑制[42][53][54]。我们的结果表明，LNPs确实促进了
可电离阳离子纳米载体的制备与表征
DSPC（1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂胆碱）、DMG-PEG2000（1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-甲基聚乙二醇2000）和胆固醇购自AVT（中国上海）。ALC-0159（2-[(聚乙二醇)-2000]-N）和ALC-0315（(4-羟基丁基)氮杂二基双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)）购自SINOPEG（中国厦门）。
脂质的制备方法是按50:10:38.5:1.5的摩尔比混合ALC-0315、DSPC、胆固醇和DMG-PEG2000。
CRediT作者贡献声明
魏华夏：撰写 - 审稿与编辑、资金获取、数据管理、概念构思。王斌瀚：撰写 - 初稿、方法学设计、实验研究、数据管理。郝颖：方法学设计、实验研究、数据管理。洪伟琪：撰写 - 初稿、数据管理。白子仪：软件开发、数据管理。秦芙蓉：方法学设计、实验研究。艾家元：方法学设计、实验研究。刘健：方法学设计、实验研究。阿卢·阿克：方法学设计、实验研究。高子睿：方法学设计伦理审批与参与同意
动物实验获得了中国四川大学生物治疗国家重点实验室动物护理与使用委员会的批准（批准编号：20220531058）。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家重点研发计划（2024YFC2310700）和四川大学华西医院卓越学科项目（ZYGD23038）的支持。图形摘要使用BioRender.com制作。
