工程化二苯基–香豆素–酰胺生物荧光探针用于选择性检测Cu2+及实时成像观察线粒体自噬过程

时间：2026年3月29日

来源：Analytica Chimica Acta

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九种二苯基-2-羟基苯甲酰亚胺衍生物（SL-1至SL-9）通过引入不同酰胺链合成，具有显著内禀电荷转移（ICT）特性、优异光热稳定性和高粘稠介质荧光增强效应。其中SL-9因高铜离子选择性、快速响应、优异灵敏度和稳定性被选为代表性探针，成功实现了活细胞（HeLa）和斑马鱼（zebrafish）中自噬过程中铜离子动态变化的实时原位监测。该模块化策略为开发高性能生物兼容荧光探针提供新范式，拓展了金属离子传感与细胞自噬研究的交叉应用。

雷松|李继伟|陈星宇|周欣怡|边叶萍|田江伟|徐海军

江苏省森林资源高效加工与利用协同创新中心，教育部林业遗传与生物技术重点实验室，江苏省农林生物质化学与利用重点实验室，南京林业大学化学工程学院，南京210037，中国

摘要

背景

香豆素类化合物广泛用作生物成像中的天然荧光染料，将其与聚集诱导发射（AIE）特性结合可以增强其发光性能。然而，针对Cu²⁺识别的基于香豆素的AIE探针的合理设计仍然是一个挑战。值得注意的是，在自噬过程中Cu²⁺浓度会发生变化，但关于在生物系统中追踪这一过程的研究仍然有限。

结果

在这项研究中，合成了九种含有不同酰胺连接结构的二苯胺-香豆素衍生物（SL-1至SL-9），并进行了系统表征。所有化合物均表现出显著的分子内电荷转移（ICT）特性、优异的光热稳定性以及在粘稠环境中的显著增强荧光发射。特别是含有酰胺或对称二肼键的染料，其辐射衰减效率高于含有羰基肼键的染料。此外，那些在固态下具有强荧光的化合物也显示出了聚集诱导发射（AIE）特性。其中，SL-9因其高选择性、快速响应、对Cu²⁺的优异检测灵敏度以及出色的稳定性而被选为代表性探针。进一步的研究表明，SL-9具有良好的生物相容性，并能够实时监测活细胞（HeLa）和斑马鱼中自噬过程中Cu²⁺的动态变化。

意义

本研究提出了一种基于二苯基-香豆素-酰胺框架的模块化策略。所提出的设计原理和机制为开发高性能荧光探针提供了新方法，这些探针在生物成像、金属离子传感和环境监测领域具有广泛应用前景。

引言

荧光染料在临床诊断和生物系统的实时监测中起着关键作用，因为它们能够精确识别和可视化关键分析物[1]。pH值、极性和粘度等关键微环境参数会深刻影响细胞生理功能，因此需要开发能够在放大目标特异性信号的同时最小化背景干扰的荧光染料[2]。香豆素（2H-2-苯并吡喃-2-酮）是一种天然的荧光团，由于其强大的电子接受能力、良好的光稳定性、独特的可修饰性和出色的生物相容性而被广泛用作荧光染料[3]。这些特性使得香豆素衍生物在生物成像[4]、[5]、[6]、生物传感[7]、[8]以及癌症的光动力/光热治疗[9]、[10]、[11]、[12]中找到了广泛的应用。然而，传统的香豆素染料在水环境中通常表现出较低的荧光量子产率（QY），主要是由于非辐射衰减的增加，例如强染料-溶剂相互作用和分子间π-π堆积[13]、[14]、[15]、[16]，这些效应会促进能量耗散并降低发射效率，从而限制了其在生理条件下的实际应用[17]。为了提高水环境中的荧光强度，化学家们开发了多种策略。

近年来，化学家们开发了多种策略来增强水环境中的荧光，包括支架固定和TICT抑制[18]、[19]、[20]。这些策略有效提高了各种香豆素荧光团的亮度。然而，增强荧光往往会导致溶解度降低[21]、光稳定性差[22]和细胞渗透性受限[23]等问题。聚集诱导发射（AIE）为这一限制提供了一种有效的解决方案：在AIE活性分子中，聚集会限制分子内的旋转和振动，从而抑制非辐射衰减并增强荧光[24]。AIE的特性不仅使其非常适合检测各种生物标志物[25]，也非常适合实时监测生理和病理过程，如肿瘤发展[26]。然而，大多数报道的AIE发光体（AIEgens）需要复杂的合成步骤，这增加了成本并引发了生物相容性问题[27]。相比之下，香豆素作为一种刚性共轭的天然荧光团，为设计AIEgens提供了理想的支架。这类受天然生物产物启发的AIEgens（BioAIEgens）可以克服传统AIEgens的弱点，具有高生物相容性、低成本和易于制备等优点[28]、[29]。引入螺旋形电子供体基团（如三苯胺（TPA）可以进一步限制分子内运动并促进AIE[30]。尽管有这些优势，传统的BioAIEgens通常具有有限的目标选择性，因为单纯的聚集并不能赋予特定的分子识别能力，这限制了它们在生物传感中的功能应用[31]、[32]。

铜离子（Cu²⁺）在酶催化、线粒体呼吸和氧化还原平衡中起着重要作用[33]、[34]。Cu²⁺的失调与氧化应激和自噬相关疾病密切相关[35]、[36]。自噬是指通过自噬-溶酶体途径选择性地降解线粒体的过程[37]。它在维持细胞稳态中起着至关重要的作用，并参与多种生理和病理过程，如炎症、代谢适应和细胞重编程[38]。因此，实时监测自噬对于阐明线粒体动态和发展针对线粒体功能障碍的治疗策略至关重要。在自噬过程中，受损的线粒体会被自噬体捕获并随后运输到溶酶体进行降解，这可能导致线粒体内容物的释放和局部Cu²⁺水平的升高[39]。然而，在细胞水平乃至体内水平上，目前关于自噬过程中铜离子动态变化的研究非常有限[4]。这一生物学背景为开发选择性的BioAIEgens探针提供了理想的案例。近年来，已经开发了多种AIE活性荧光探针用于检测Cu²⁺，如表S1所总结的。这些早期探针通常具有响应迅速和显著的AIE效应等优点。然而，它们的实际应用仍面临一些挑战。例如，一些探针的合成路线相对复杂，且许多探针的发射波长较短（<550 nm）。更重要的是，大多数探针仅限于检测外源性的Cu²⁺，缺乏监测活体内Cu²⁺波动的能力，尤其是在亚细胞器水平上。

为了解决这些挑战，设计并合成了一系列二苯基-香豆素-酰胺衍生物（SL-1至SL-9），采用了两种互补策略：（i）通过引入二苯胺作为AIE活性供体来限制分子内运动并增强AIE，从而提高高含水环境中的荧光量子产率；（ii）通过结合酰胺、肼和二肼连接结构作为Cu²⁺的配位位点来实现目标选择性。系统的光物理表征和DFT计算揭示了结构修饰如何影响发射效率、聚集行为和金属选择性。在这些化合物和已报道的香豆素-酰胺衍生物中（表S2），SL-9在高含水介质中表现出高荧光量子产率和对Cu²⁺的强选择性。SL-9还被用于实时成像活细胞HeLa和斑马鱼中的线粒体自噬过程中Cu²⁺动态，展示了这种选择性BioAIEgens探针在研究金属离子相关生物过程中的潜力。因此，二苯基-香豆素-酰胺平台为开发下一代BioAIEgens用于实时体内成像和环境监测应用提供了概念和实际上的进步。

合成

化合物SL-1至SL-9的合成路线、分子结构和相应的命名在方案1和图S1中进行了概述。4-(二苯胺基)-2-羟基苯甲醛根据已报道的程序合成[31]。在哌啶催化下，4-(二苯胺基)-2-羟基苯甲醛与二乙基马来酸酯发生Knoevenagel缩合，随后酸化得到Cou-COOH。随后，2-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐

结论

成功合成了一系列二苯基香豆胺衍生物（SL-1至SL-9），并系统研究了它们在溶液、聚集态和固态下的光物理性质。结合理论计算，探讨了酰胺连接变化对结构-活性关系的影响。引入二苯胺单元使大多数衍生物（SL-1、SL-2、SL-5至SL-9）具有AIE特性，增强了ICT并拓宽了

实验部分

所有化学品和溶剂均为分析纯度，除非另有说明，否则按接收状态直接使用。反应用溶剂根据标准程序纯化并干燥后使用。所有混合溶剂的体积比均为v/v。¹H和¹³C NMR光谱是在Bruker DRX-600/400 AVANCE III光谱仪上收集的。¹H NMR光谱的化学位移以ppm为单位记录，相对于CDCl₃（δ = 7.26 ppm）或DMSO-d_{6（δ = 2.5 ppm）作为内标。}

CRediT作者贡献声明

田江伟：撰写 – 审稿与编辑，项目管理，资金获取，概念构思。徐海军：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理，研究，概念构思。李继伟：撰写 – 原稿撰写，方法学，研究，资金获取，数据分析，数据管理，概念构思。陈星宇：方法学，数据分析，数据管理。周欣怡：方法学，研究，数据管理。边叶萍：撰写 – 审稿与