在茶叶的世界里，有一种“黄金菌”对黑茶独特风味的形成至关重要，它就是冠突散囊菌（Eurotium cristatum）。这种真菌在黑茶（如茯砖茶）的发酵过程中扮演着核心角色，其丰富的酶系统能够高效转化茶叶内的成分，提升茶汤的香气和口感。近年来，它的应用更是拓展到改善夏秋绿茶、桑叶茶等的风味与功能。然而，冠突散囊菌的生长与代谢并非一成不变，在其生命周期中，它会根据环境条件在“有性生殖”和“无性生殖”两种模式间切换。研究表明，有性生殖阶段产生的孢子（子囊孢子）是多种生物活性物质的主要富集部位，其分泌的胞外水解酶活性也显著更强。这意味着，如果能诱导和控制真菌更多地进入有性生殖阶段，将有望大幅提升发酵效率、优化产物品质。但问题是，驱动这种生殖模式转换的分子“开关”究竟是什么？除了已知的基因层面调控，是否还存在其他未被发现的调控分子？
为了解开这个谜题，一项新的研究将目光投向了环状RNA（circRNA）。circRNA是一类结构呈闭合环状的非编码RNA分子，因其稳定性高、表达具有组织和时空特异性，在动物和植物的发育、代谢等过程中被证实具有重要调控功能。然而，在真菌，尤其是像冠突散囊菌这样的工业应用真菌中，circRNA的作用几乎还是空白。研究人员想知道，circRNA是否在冠突散囊菌的生殖分化和伴随的代谢活性变化中扮演着关键角色？它们又是如何协调这些复杂生命活动的？
为此，研究团队开展了一项系统性的研究。他们分别培养了冠突散囊菌的有性菌丝体（L01，在低盐条件下诱导）和无性菌丝体（L02，在高盐条件下诱导），观察了二者的形态差异。随后，研究人员对两种菌丝体进行了circRNA高通量测序，并同步检测了关键的生理表型，包括孢子产量以及纤维素酶、果胶酶、蛋白酶和多酚氧化酶这四种与茶叶成分转化密切相关的胞外水解酶活性。通过生物信息学分析，他们鉴定出在两种生殖类型间差异表达的circRNA，并对这些circRNA的来源基因进行了功能富集分析，最后通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）对测序结果进行了验证。这项研究成果最终发表在了《CyTA - Journal of Food》期刊上。
为开展此项研究，作者主要应用了以下几个关键技术方法：首先，通过调控培养基盐浓度（0.5 mol/L NaCl诱导有性生殖，3 mol/L NaCl诱导无性生殖）成功获得表型清晰的冠突散囊菌有性（L01）与无性（L02）菌丝体样本。其次，对样本总RNA进行核糖体RNA去除后，利用Illumina HiSeq平台进行链特异性转录组测序。接着，使用Find_circ软件基于回文剪接点识别circRNA，并利用edgeR软件进行差异表达分析。此外，运用基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库对差异circRNA的来源基因进行功能富集分析。同时，采用血球计数板法动态监测发酵液中的孢子产量，并使用3,5-二硝基水杨酸法、福林-酚法等标准生化方法测定四种关键水解酶的活性。所有关键实验均设置了三个独立的生物学重复以确保结果的可靠性。
研究结果
3.1. 两种冠突散囊菌菌丝体类型的形态学观察
有性菌丝体菌落呈金黄色，表面致密，中央有深褐色渗出物，其有性生殖结构为子囊壳，成熟后释放表面粗糙、具有两条“冠状”脊的子囊孢子。无性菌丝体菌落呈浅灰绿色，表面平坦，其无性生殖结构为分生孢子头，产生的分生孢子主要为椭圆形，外壁有细小的棘状突起。这从形态上证实了两种培养条件下获得了不同的生殖类型。
3.2. 测序数据质量评估与circRNA鉴定
测序数据质量优良，比对效率高。共鉴定出1,818个高可信度的circRNA，其中61.65%来源于外显子区。多数circRNA长度在200-1600个核苷酸之间。在有性菌丝体（L01）中鉴定到1,121个circRNA，在无性菌丝体（L02）中鉴定到814个，两者仅有117个共通，表明circRNA的表达具有高度的生殖阶段特异性。
3.3. 差异表达circRNA（DE-circRNA）分析
比较分析发现了52个DE-circRNA，其中29个在有性菌丝体（L01）中显著上调，23个在无性菌丝体中上调。聚类热图显示这些circRNA能清晰区分两种生殖类型的样本。
3.4. DE-circRNA来源基因的GO与KEGG功能富集分析
GO分析显示，DE-circRNA的来源基因在“代谢过程”、“催化活性”、“细胞器”等基本生物学功能中富集。KEGG通路分析则揭示，这些基因显著富集于氧化磷酸化、嘧啶代谢、氨基酸生物合成等核心代谢通路。这提示DE-circRNA可能通过调控能量和基础物质代谢来影响生殖表型。
3.5. RT-qPCR验证DE-circRNAs
随机选取6个DE-circRNA进行RT-qPCR验证，其表达趋势与高通量测序结果高度一致，证实了测序数据的可靠性。
3.6. 冠突散囊菌生理特性分析及其与DE-circRNAs的关联
生理测定显示，有性菌丝体（L01）在孢子产量和四种水解酶活性上均显著优于无性菌丝体（L02）。发酵结束时，L01的孢子产量是L02的约3.4倍；其纤维素酶、果胶酶、蛋白酶和多酚氧化酶活性分别是L02的2.01倍、2.33倍、3.61倍和1.19倍。这种显著的表型优势与在有性菌丝体中特异性上调的29个circRNA及其富集于能量和合成代谢通路的功能相吻合，为有性生殖阶段高产孢、高酶活的生理优势提供了分子层面的解释。
研究结论与意义
本研究首次构建了冠突散囊菌生殖相关的circRNA图谱，系统揭示了circRNA在其生殖分化与代谢调控中的潜在作用。研究发现，有性菌丝体在孢子产量和关键水解酶活性上的显著优势，与其特异性高表达的circRNA密切相关。这些上调的circRNA，其来源基因主要富集于氧化磷酸化、嘧啶代谢和氨基酸生物合成等为高耗能生命活动（如孢子形成）和蛋白质（如酶）合成提供能量与前体的核心通路。这暗示这些circRNA可能通过协调调控从能量供应到物质合成的代谢网络，从而协同驱动了高产孢与高酶活的表现。
研究还特别指出了几个关键的DE-circRNA作为未来深入研究的靶点。例如，来源于孢子壁成熟关键基因omt2 的circRNA在有性菌丝体中显著上调；而来源于调控无性发育和次级代谢的全局调控因子laeA 的circRNA则在有性菌丝体中下调，其下调可能解除了对laeA 的抑制，有利于向有性生殖转换。这些发现为理解circRNA如何精细调控关键发育基因的表达提供了具体线索。
这项研究的科学意义在于，它将circRNA的研究领域拓展到了具有重要工业价值的丝状真菌，为真菌生殖发育的转录后调控机制增添了新的认知。从应用角度看，该研究鉴定出的关键DE-circRNA（如与omt2 、laeA 相关的circRNA）可作为潜在的分子靶标。未来通过基因操作手段（如敲低或过表达）调控这些特定circRNA，有望发展出一种新的策略，在工业发酵中定向促进冠突散囊菌的有性生殖阶段，从而高效提升其有益代谢物的产量和发酵产品的品质，例如优化黑茶的风味与健康功效。总之，该研究不仅为理解冠突散囊菌的生物学特性提供了新视角，也为通过分子策略改良工业微生物性能奠定了重要的理论基础。
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