李彦军|贾存阳|胡金航|唐超军|郑涛|王健|牛春红|刘志涵|白志强|王玉星
中国山西省大同市山西大同大学免疫学研究所
摘要
背景
自身免疫性心肌炎是由于免疫功能障碍导致的心肌局部或弥漫性炎症。人参中的一种重要生物活性成分——人参皂苷，被用于治疗癌症、免疫疾病和糖尿病。在各种人参皂苷中，人参皂苷Rb1以其抗病毒、抗炎、抗氧化、抗凋亡和调节自噬的作用而脱颖而出。我们期望研究人参皂苷Rb1在MyHC-α614-629诱导的实验性自身免疫性心肌炎（EAM）小鼠模型中的保护作用。
方法
48只Balb/c小鼠被随机平均分为六组：阴性对照组、EAM组、PBS组以及三个不同剂量的人参皂苷Rb1处理组（20 mg/kg、40 mg/kg和80 mg/kg）。第二次免疫后，小鼠每天口服给予不同剂量的人参皂苷Rb1（20 mg/kg、40 mg/kg和80 mg/kg）。第21天，采集小鼠的心脏和脾脏组织并称重，检测外周血淋巴细胞的比例。使用HE染色观察心肌组织的病理变化；使用Masson染色检测心肌组织的纤维化变化；通过免疫组化方法检测心肌组织中肌钙蛋白I（cTnⅠ）、CD4、CD8、F4/80、IL-1β、Tlr2和Tlr4的表达变化；利用qRT-PCR和Western blotting技术检测心肌组织中CD4、CD8、F4/80、Ly6G、cTnⅠ、IL-1α、IL-1β、IL-6、Tlr2和Tlr4相关基因的表达变化。
结果
EAM小鼠表现出明显的心脏扩大（P < 0.001）和面色苍白。EAM组的小鼠体重增长缓慢，同时心脏重量（HW）和脾脏重量（SW）增加，且HW/BW比值也显著升高（P < 0.001）。外周血淋巴细胞的比例也有所增加（P < 0.001）。心肌组织中的炎症浸润和纤维化加剧，同时免疫细胞标志物F4/80、CD4和CD8以及心肌损伤标志物cTnⅠ的表达上调（P < 0.001）。40 mg/kg和80 mg/kg剂量的人参皂苷Rb1处理显著改善了这些表型和病理特征。机制分析显示，EAM小鼠的心肌组织中IL-1α、IL-1β、IL-6、Tlr2、Tlr4、Notch1和Hes1的表达显著上调，其中IL-6的表达增幅最为显著（P < 0.001）。
结论
人参皂苷Rb1通过TLr2/Tlr4信号通路下调促炎细胞因子的表达，从而对EAM小鼠具有保护作用。本研究为心肌炎的潜在临床治疗奠定了基础。
引言
心肌炎是指心肌的局部或广泛性炎症，可能由感染性或非感染性原因引起[1,2]。与心肌炎相关的病原体包括病毒、细菌、支原体、衣原体和真菌。临床上，心肌炎可表现为心悸、心律不齐、胸闷或疼痛以及呼吸困难等症状，还可能导致心力衰竭和心肌收缩或舒张功能障碍，甚至引发猝死[3]。心肌炎主要影响儿童和年轻人[4,5]。自身免疫反应是心肌损伤的重要致病机制，且其发病率近年来显著上升[6]。2021年全球新发心肌炎病例约为131.9万例，导致31,700人死亡。2019年至2021年间，心肌炎的发病率略有上升[7]。临床试验表明，免疫抑制疗法可以缓解心肌病的相关症状。感染性心肌炎是由病毒和细菌等病原体引起的心肌炎症；而EAM模型通常用于研究由自身免疫机制引起的非感染性心肌炎[8,9]。
人参来源于植物Panax ginseng C. A. Mey的干燥根和根茎[10]，具有增强抗休克能力、强心作用、调节免疫功能和促进造血的作用[11][12][13]。人参中的一种重要生物活性成分——人参皂苷，被用于治疗癌症[15,16]、免疫疾病[17]和糖尿病[18,19]。在各种人参皂苷中，人参皂苷Rb1因其抗病毒、抗炎、抗氧化、抗凋亡和调节自噬的作用而备受关注[15,20,21]。在心肌缺血/再灌注损伤（MIRI）中，适度的自噬通过清除受损线粒体起到保护作用[22]。黄芩素和人参皂苷Rb1通过调节GRK2/AT1R/MasR网络抑制心肌成纤维细胞的活化[23]。人参皂苷Rb1与PRDX6联合使用可有效保护心肌免受损伤，两者共同作用可减轻炎症、凋亡和氧化应激[21]。
TLR是一类古老的模式识别受体（PRR），在先天免疫中起着关键作用[24]。目前，研究人员已在小鼠中鉴定出12种TLR，在人类中鉴定出10种[25,26]。这些受体属于I型跨膜蛋白，具有细胞内、跨膜和细胞外结构域。根据其亚细胞定位，TLR可分为两大类：TLR3、TLR7、TLR8和TLR9位于内体中，而TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR11则位于细胞膜上[26]。
在病毒性心肌炎（VMC）中，受影响小鼠的TLR4和NF-κB被过度激活[27,28]。由CVB3引起的心肌炎中，TLR4和磷酸化NF-κB p65的表达显著增加，同时炎症细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和INF-γ的水平也升高[29]。黄芪皂苷（AST）显著提高了VMC小鼠的存活率，这可能是由于AST能够抑制TLR4/NF-κB p65信号通路，从而减轻心肌组织的炎症反应[30]。
心肌炎的症状多样，包括非特异性胸痛、胸闷、呼吸困难和心悸。由于这些症状与其他疾病（如冠状动脉疾病）的症状相似，心肌炎常被误诊[2]。因此，寻找有效的预防和治疗策略至关重要。
目前尚不清楚人参皂苷Rb1对心肌炎的治疗效果及其作用机制。本研究将采用系统生物学方法[31]，利用新兴的计算方法来识别心血管疾病中的免疫调节靶点。鉴于人参皂苷Rb1具有显著的抗炎作用，且TLR2/TLR4信号通路是已知的炎症通路，我们将使用EAM小鼠模型来研究人参皂苷Rb1在治疗心肌炎中的保护作用及其涉及的TLR2/TLR4信号通路调控机制。
研究对象
48只5-6周龄的雄性Balb/c小鼠购自北京华福康生物技术有限公司。所有动物实验均获得了山西大同大学医学与生物学伦理委员会动物护理和使用委员会（IACUC-24M06019）的批准（中国大同）。
小鼠模型的建立
48只Balb/c小鼠被随机平均分为六组：阴性对照组、EAM组、PBS组以及三个不同剂量的人参皂苷Rb1处理组（20 mg/kg、40 mg/kg和80 mg/kg）。
EAM小鼠模型的建立
小鼠在第1天和第8天通过腹股沟区域多次皮下注射0.2 mg的MyHC-α614-629肽悬液进行免疫。从第8天开始，小鼠每天口服给予不同剂量的人参皂苷Rb1（20 mg/kg、40 mg/kg和80 mg/kg），直至第21天进行解剖（图1A）。结果显示，EAM组的小鼠心脏颜色较苍白，心脏和脾脏均显著增大（图1B–表S1）。
讨论
心肌炎是一种炎症性心脏病，可分为感染性和非感染性两大类。非感染性心肌炎可能由有毒物质、药物、系统免疫疾病等因素引发[1,35]。本研究主要探讨自身免疫性心肌炎。
人参皂苷Rb1作为人参皂苷的关键成分，具有抗病毒、抗炎、抗氧化、抗凋亡和调节自噬的作用，因此成为研究的重点。
伦理批准
所有动物实验均按照山西大同大学生物医学研究伦理审查委员会（IACUC-24M06019）批准的方案进行（中国大同）。
资助
本研究得到了以下项目的支持：山西省高等教育机构科技创新计划（2024L320）对Y.L.的资助；大同市科技计划项目（2025041）对Y.L.的资助；山西省基础研究计划（202203021221210）对J.W.的资助；山西省大学生创新创业培训计划（20240920）对Z.L.的资助；中国博士后科学基金会（2024M751843）对Y.W.的资助；以及山东省博士后项目的资助。
作者贡献声明
李彦军：概念构思、数据管理、资金获取、项目管理、软件开发、初稿撰写及审稿编辑。
贾存阳：数据分析、监督、结果可视化。
胡金航：实验设计、验证、结果可视化。
唐超军：概念构思、项目管理。
郑涛：数据分析、项目管理。
王健：资金获取、项目管理。
牛春红：结果验证、可视化。
刘志涵：资金支持。
利益冲突声明
作者声明不存在任何利益冲突。
