实体肿瘤，这个医学界的“顽固分子”，长期挑战着传统疗法乃至新兴免疫疗法的极限。以嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法为代表的免疫疗法虽然在治疗血液癌症方面取得了显著成效，但在对付实体瘤时却常常显得力不从心。近年来，嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR-M）疗法作为一种新兴的实体瘤免疫治疗策略，因其固有的肿瘤浸润能力和效应功能而崭露头角，为攻克这一难题带来了新希望。然而，现有的CAR-M制备主要依赖病毒转导，这种方法与异常的免疫原性和毒性风险相伴，限制了其安全性和广泛应用。同时，mRNA作为一种非整合、可调控的治疗分子，虽在CAR疗法中潜力巨大，但其自身难以跨越细胞膜，需要高效的递送载体。目前临床常用的电穿孔（EP）技术又存在细胞毒性、可扩展性差等局限。于是，寻找一种更安全、高效的CAR-M工程化方法，便成为了推动实体瘤免疫治疗发展的关键科学问题。发表在《Bioengineering & Translational Medicine》上的这项研究，正是为了破解这一难题而生。
为开展研究，作者主要运用了以下关键技术：1) 脂质纳米颗粒（LNP）合成与优化：合成了24种离子化脂质库，通过微流控混合技术构建mRNA-LNP，并利用正交实验设计（DoE）系统优化了LNP的辅料（离子化脂质、DOPE、胆固醇、PEG-脂质）摩尔比及理化性质（如尺寸、mRNA包封率）。2) 细胞模型与功能验证：使用PMA分化的THP-1人巨噬细胞系进行LNP递送效率的初筛和优化；使用从宾夕法尼亚大学人类免疫学核心机构获取的健康供体外周血分离的CD14+原代单核细胞，在GM-CSF或M-CSF诱导下分化为原代人巨噬细胞，用于验证LNP的转化潜力。3) 机制与表型研究：利用抗体介导的受体阻断和小分子抑制剂，探究LNP被巨噬细胞摄取的细胞外和细胞内途径；通过NanoString多重基因表达分析，评估LNP处理对原代人巨噬细胞表型的影响。4) 功能学评估：构建编码HER2靶向嵌合抗原受体（HER2-CAR）的mRNA，用优化后的LNP转导原代巨噬细胞，并通过与HER2+ Luc+ SKOV3人卵巢癌细胞共培养的离体杀伤实验，验证工程化CAR-M的功能。
3.1 Screen of piperazine-derived ionizable lipids in THP-1 macrophages
研究人员首先合成了一个包含24种离子化脂质的文库，其中一部分脂质的设计灵感来源于巨噬细胞对天然氧化脂质结构的内在亲和力。将这些脂质与胆固醇、DOPE和C14-PEG2000按固定摩尔比混合，通过微流控技术制成包裹荧光素酶编码mRNA的LNP。在PMA分化的人THP-1巨噬细胞中进行筛选，发现含有较长烷基链（C14和C16）及氧化胺核心（C、F、G）的生物启发氧化离子化脂质倾向于具有更高的mRNA转染效率。其中，C16-C脂质表现最优，在递送效率上显著优于金标准C12-200 LNP，且细胞毒性最低。
3.2 Optimization of C16-C LNPs using orthogonal DoE
在确定C16-C为先导脂质后，研究团队采用正交实验设计（DoE）对其LNP的辅料组成进行两轮优化。第一轮（文库A）在较宽的辅料比例范围内筛选，发现离子化脂质含量较高、DOPE和胆固醇含量较低的配方（如A12）表现出更强的递送能力。基于此趋势，第二轮（文库B）以A12为中心点，在更高离子化脂质含量、更低胆固醇和DOPE的范围内进行精细优化。最终获得的B15配方，其mRNA递送至THP-1细胞的效率比基础配方提高了13倍，且无明显毒性。分析表明，离子化脂质含量是驱动巨噬细胞内递送的主要因素。
3.3 Optimization of B15 LNPs by carrier: Cargo (wt:Wt) formulation ratio
研究人员进一步探索了离子化脂质与mRNA重量比（wt:wt）对递送效率的影响。对于离子化脂质含量较低的基础配方，提高重量比可增强递送；而对于离子化脂质含量已很高的B15配方，进一步提高重量比反而会降低递送效率。这表明，在优化离子化脂质含量的同时，也需要适量的胆固醇、DOPE等辅料来维持LNP的稳定性，以实现最佳递送效果。
3.4 Microfluidic-based physicochemical optimization of the B15 LNPs
通过调节微流控混合设备的总流速（TFR），研究人员能够调控LNP的流体动力学半径。结果表明，在较高TFR下制备出的更小尺寸的LNP（约60-80 nm）具有更高的mRNA包封率和更强的巨噬细胞转染能力。因此，后续研究选择在2.4 mL/min的TFR条件下制备B15 LNP，作为完全优化的制剂用于后续实验。
3.5 Extracellular pathways associated with LNP uptake and mRNA delivery to macrophages
为探究LNP被巨噬细胞摄取的机制，研究人员使用了抗体介导的受体阻断实验。结果表明，清除受体（如MARCO、CD204）和脂蛋白受体（LDLR）的阻断仅能部分降低递送效率，且这种抑制效应具有血清浓度依赖性。体内生物分布成像显示，优化后的B15 LNP静脉注射后在小鼠体内主要趋向于脾脏而非肝脏，这与强ApoE（载脂蛋白E）结合型LNP（如C12-200）的肝脏趋向性不同，提示B15 LNP的摄取在很大程度上是ApoE非依赖性的。
3.6 Small molecule inhibition of endocytic and phagocytic pathways associated with LNP uptake and mRNA delivery
利用小分子抑制剂面板干扰不同的细胞内吞和吞噬途径后发现，巨胞饮作用（macropinocytosis）的选择性抑制剂EIPA能够几乎完全抑制mRNA的递送。而通常与吞噬作用密切相关的肌动蛋白聚合抑制剂（细胞松弛素B/D）影响相对较小。这提示，非特异性、流体相的巨胞饮作用是B15 LNP进入巨噬细胞并实现mRNA胞质递送的主要途径。
3.7 Optimized B15 LNPs do not induce changes in macrophage phenotype
考虑到LNP可能具有固有免疫原性，研究人员通过NanoString基因表达分析评估了B15 LNP对原代人巨噬细胞表型的影响。结果显示，与未处理的巨噬细胞相比，LNP处理24小时后仅引起8个基因的微小差异表达（使用未校正p值<0.05），且无基因在错误发现率校正后达到显著差异。B15 LNP并未诱导显著的促炎反应，反而略微降低了IRF1和IL6等炎症相关基因的表达，表明其在离体工程化应用中是安全的，不会引起不必要的免疫激活。
3.8 Validation of optimized B15 LNPs in MCSF- and GMCSF- ex vivo models of primary human macrophages
研究在GM-CSF和M-CSF两种因子诱导分化的原代人巨噬细胞模型中验证了B15 LNP的转化潜力。B15 LNP在这两种模型中均能高效递送荧光素酶mRNA和GFP（绿色荧光蛋白）mRNA，其效率远超基础配方。值得注意的是，GM-CSF来源的巨噬细胞表现出更强的异质性，其GFP表达谱与腺病毒（AdV）转染相似，而M-CSF来源的巨噬细胞则几乎全部被高效转染。这证实了B15平台适用于不同极化状态的原代人巨噬细胞。
3.9 Oxidized B15 LNPs can engineer functional HER2-CAR-Ms ex vivo
最后，研究团队使用B15 LNP包裹编码HER2-CAR的mRNA，对GM-CSF来源的原代人巨噬细胞进行工程化。流式细胞术检测显示，B15 LNP处理的巨噬细胞CAR阳性率（~18%）显著高于基础配方（~3%）。在随后与HER2+ Luc+ SKOV3卵巢癌细胞的离体共培养杀伤实验中，两种LNP工程化的CAR-M均能实现剂量依赖性的、强效的抗原特异性肿瘤细胞杀伤。虽然由于CAR阳性细胞数量设置相同，两组间的杀伤效率无统计学差异，但B15 LNP更高的转染效率为其临床转化奠定了关键基础。
4 CONCLUSION
综上所述，本研究成功开发了一种新型的、生物启发的氧化mRNA-LNP递送平台，用于人CAR-M的高效、低毒离体工程化。通过系统性优化，获得了性能卓越的B15 LNP配方。机制研究表明，该LNP主要通过ApoE非依赖性的巨胞饮途径被巨噬细胞摄取，并在体内表现出向脾脏等肝外器官富集的趋向性。重要的是，该LNP本身不引起巨噬细胞的显著表型改变。研究最终证实，利用该平台工程化的原发性人HER2-CAR-Ms在离体条件下具有强大的抗肿瘤功能。这项工作的意义在于，它为解决当前CAR-M疗法中病毒载体相关的安全性和制造难题提供了一种有前景的非病毒替代方案。该平台的灵活性使其有望用于针对多种靶点的CAR-M开发，不仅为实体瘤免疫治疗开辟了新途径，也为巨噬细胞参与的其他疾病（如动脉粥样硬化、代谢性疾病）的细胞疗法奠定了基础。
