在癌症精准医学时代，液体活检（LB）已成为一种革命性的微创工具，而循环肿瘤DNA（ctDNA）分析在其中扮演着核心角色。ctDNA是从肿瘤细胞释放到血液中的DNA片段，携带着肿瘤特异性的突变、拷贝数变异、染色体重排和甲基化改变等信息，是早期检测、疾病监测和治疗分层的关键生物标志物。然而，ctDNA在总游离DNA（cfDNA）池中通常只占约0.1%–1.0%，这就像“大海捞针”，使得高灵敏度的检测至关重要。这篇综述揭示了影响“捞针”成功率的一系列复杂因素，而这些因素都发生在前分析阶段。
昼夜节律能否影响ctDNA分析？
人体的生物钟不仅调节睡眠-觉醒周期，也影响着细胞的生死。研究表明，一些昼夜节律基因（如PER、CRY、BMAL1、CLOCK）的表达能够诱导正常细胞和癌细胞的凋亡。在结直肠癌患者中观察到，cfDNA水平在一天的不同时间点会出现峰值，且晚期患者的甲基化Septin 9（SEPT9）在午夜检出率更高。虽然并非所有研究都支持cfDNA存在显著的昼夜波动，但这提示细胞死亡和cfDNA释放可能受到生物钟的调控，进而潜在地影响ctDNA的比例和可检测性。因此，确定标准化的采血时间或许是未来提高检测一致性的一个方向。
性别与衰老：cfDNA动力学的决定因素
生物学性别和衰老进程是cfDNA水平的两个重要调节器。男性通常因肌肉质量、红细胞计数和雄激素水平较高而表现出比女性更高的cfDNA基线。衰老则与氧化应激增加和生理功能衰退相伴，导致细胞死亡加剧，从而使得老年人的cfDNA水平显著高于年轻人，老年女性群体中这一趋势尤为明显。绝经后妇女的cfDNA水平也高于绝经前妇女，这可能与激素变化或衰老本身有关。这些由性别和年龄驱动的cfDNA背景变化，可能会稀释肿瘤来源的ctDNA信号，对检测灵敏度构成挑战，尤其是在女性及老年癌症患者中，其影响有待进一步研究明确。
饮食相关的代谢综合征会影响ctDNA分析吗？
不健康的饮食导致的肥胖和糖尿病等代谢综合征，是众所周知的癌症风险因素。它们通过促进系统性炎症和加剧细胞死亡（如坏死、凋亡）来拔高血液中的总cfDNA水平。研究发现，肥胖个体的体脂百分比与cfDNA浓度呈正相关，其内脏脂肪组织、炎症和胰岛素抵抗程度加剧了cfDNA的释放，中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的形成也是重要来源。虽然糖尿病对ctDNA水平的直接影响尚不明确，但它与脂肪细胞和肾细胞的死亡增加有关。这些与癌症共存的饮食相关慢性病，无疑是ctDNA分子分析中必须考虑的混淆因素。
吸烟会增加ctDNA水平吗？
吸烟的危害不仅在于增加癌症发病率，还直接影响治疗效果。烟草会诱导血管平滑肌细胞发生铁死亡，导致患者cfDNA浓度升高。有趣的是，在非小细胞肺癌（NSCLC）患者中，非吸烟者血浆中表皮生长因子受体（EGFR）突变的检出率反而高于吸烟者。这可能是因为吸烟引起的广泛细胞死亡释放了大量非肿瘤来源的cfDNA，如同增大了“干草堆”的体积，使得寻找“EGFR突变”这根“针”变得更加困难。
体育锻炼如何影响ctDNA水平？
剧烈的体力活动会暂时扰乱体内平衡。研究表明，极限运动后15分钟，血浆cfDNA水平可激增至峰值，约1小时后恢复正常。成熟的中性粒细胞是运动后cfDNA的主要来源。尽管运动同时也会增强血清DNA酶（DNase）的活性，促进NETs的降解，但由运动应激引起的cfDNA峰值仍可能掩盖临床上相关的ctDNA突变，成为检测的干扰项。因此，在安排采血时，有必要考虑患者近期的体力活动情况。
是否应考虑肿瘤分期和治疗方法对ctDNA分析的影响？
ctDNA的检测率和应用价值与疾病阶段紧密相关。在早期癌症中，它主要用于疾病检测；而在晚期转移性疾病中，则更适用于监测和指导治疗。通常，转移性疾病患者的ctDNA更易被检出。各种癌症治疗方法，包括化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗，在杀死癌细胞的同时会暂时性地增加血液中的ctDNA水平。若治疗有效，随着肿瘤负荷减少，ctDNA水平会随之下降。手术创伤则会显著增加总cfDNA的释放，这种影响可持续长达4周，可能导致术后早期ctDNA比例低于检测下限。因此，建议在术后至少1-2周再采集血样用于ctDNA分析。
采集管与处理时间对ctDNA分析的影响
样本的采集与处理是前分析阶段的技术核心。与血清相比，血浆是更优的选择，因为血清制备过程中的细胞裂解会释放大量基因组DNA，稀释肿瘤DNA。在常用的乙二胺四乙酸（EDTA）采血管中，血液采集后4-6小时内白细胞会发生裂解，导致野生型DNA增加，可能掩盖ctDNA信号。虽然市面上有能更好稳定ctDNA的专用采血管，但EDTA管因成本低、与现有工作流程兼容度高，目前仍是大多数研究和临床环境中的首选。
cfDNA分离方法的比较与储存考量
从血浆中高效提取cfDNA是保证后续分析灵敏度的关键步骤。目前主流方法包括柱式法和磁珠法。比较研究显示，以QIAamp循环核酸试剂盒为代表的柱式法在cfDNA回收率和对低频突变的检测灵敏度上表现更优。而磁珠法则在自动化处理和规模化应用上具有优势。无论采用何种方法，提取后的血浆样本应在-80°C下保存，以维持cfDNA长达9个月的稳定性，但长期储存仍需考虑DNA的渐进性降解。
结论：走向标准化的前分析流程
ctDNA分析为肿瘤学带来了前所未有的机遇，但其结果的可靠性严重依赖于对前分析变量的控制。生物特征、生活方式、疾病状态和治疗干预等多种因素都会动态影响总cfDNA水平，而其中许多因素只会增加非肿瘤来源的背景DNA，从而稀释微量的ctDNA，增加假阴性风险。当前，虽然已有一些ctDNA检测被批准用于临床，但全球范围内仍缺乏统一的前分析标准。正如美国临床肿瘤学会（ASCO）和美国病理学家协会（CAP）所强调的，建立并采用协调一致的前分析协议，对于减少变异、提高不同临床和研究环境间的可重复性至关重要，这也是充分释放液体活检在精准医疗中潜力的关键一步。
