在当今农业领域，一种名为灰霉病的病害如同“隐形杀手”，每年在全球范围内造成巨大的经济损失。其罪魁祸首是一种名为灰葡萄孢（Botrytis cinerea）的真菌。这种真菌生命力顽强，寄主范围极广，可侵染超过1400种植物，包括葡萄、草莓、番茄等高价值经济作物。传统的防治手段严重依赖化学杀菌剂，然而，长期大量使用不仅带来了环境污染和食品安全风险，更催生了日益严峻的病原菌抗药性问题。尤其对于遗传变异快、繁殖周期短的B. cinerea而言，寻找高效、环保且不易产生抗性的替代防治策略，已成为农业可持续发展的当务之急。
在此背景下，生物防治剂（Biological Control Agents, BCAs），特别是具有抗真菌活性的细菌，展现出巨大的应用前景。它们通过产生抗菌代谢物、竞争营养空间或诱导植物系统抗性等多种机制来对抗病原菌，不易诱导病原菌产生单一机制的抗性。目前市场上的生物防治产品大多依赖芽孢杆菌属（Bacillus spp.）菌株，为了降低对单一活性成分的依赖，丰富生防菌的资源库，并开发具有不同作用机制的生防产品显得至关重要。为了探索新的解决方案，一项研究聚焦于从葡萄牙植物根际分离出的两种细菌菌株，对它们防治灰霉病的潜力进行了深入的评估。这项题为“Serratia quinivorans NFX21和Pseudomonas thivervalensis NFX104的功能与基因组学特征：抗Botrytis cinerea的新型生物防治剂”的研究发表在国际期刊《Plants》上。
研究者们采用了多学科交叉的研究方法。首先，通过体外对峙培养和孢子萌发抑制实验评估菌株的直接抗真菌活性。其次，利用番茄离体叶片和盆栽活体植株的致病性实验，验证菌株在植物体内的病害防控效果。关键的基因组学分析则通过全基因组测序（Whole-genome sequencing）和生物信息学工具完成。研究者对菌株进行了完整的基因组测序和组装，并利用antiSMASH软件预测了其次级代谢物生物合成基因簇（Biosynthetic Gene Clusters, BGCs），同时通过功能注释和比较基因组学分析，挖掘了可能与抗真菌活性相关的基因和通路。实验中使用的番茄品种为“Moneymaker”（Solanum lycopersicum L. cv. Moneymaker）。商用生物杀菌剂Serenade ASO®（活性成分为Bacillus amyloliquefaciens QST 713）在整个研究中被用作阳性对照，以评估NFX菌株的商业化应用潜力。
2. 结果
2.1. 菌株NFX21和NFX104显著抑制灰葡萄孢的菌丝生长和分生孢子萌发
研究人员首先通过体外实验评估了菌株的直接抗真菌能力。在对峙培养实验中，NFX21和NFX104菌株均能显著抑制B. cinerea的菌丝生长，抑制率分别达到34.5%和35.8%。在分生孢子萌发实验中，两种菌株在所有测试浓度下（OD600nm= 0.05, 0.1, 0.5）都显著抑制了孢子的萌发和早期菌丝发育。相比之下，商用菌株QST 713在最低浓度下效果减弱，但在较高浓度下表现与NFX菌株相当。这些结果表明，NFX21和NFX104能有效干扰病原菌的早期生长阶段。
2.2. 菌株NFX21和NFX104在番茄离体叶片和盆栽实验中显著降低灰霉病发生率
为了验证菌株在植物体内的实际防效，研究分别在番茄离体叶片和盆栽植株上进行了实验。在离体叶片实验中，与未处理的感染对照相比，施用NFX21和NFX104可显著降低病害发生率，分别降至约27%和38%，效果与Serenade ASO®相当。在盆栽实验中，施用菌株同样显著降低了叶片感染率和病害严重程度。例如，NFX21处理将病害发生率从对照的39%降低至26%，病害严重程度（受感染叶面积百分比）从6.3%降至3.2%。这些数据证实了NFX菌株在更接近真实农业环境的条件下依然具备有效的生防潜力。
2.3. 菌株NFX21和NFX104的基因组学特征
通过全基因组测序，研究人员明确了两种菌株的分类学地位。系统基因组学分析表明，菌株NFX21与Serratia quinivorans NCTC11544T具有高度同源性，菌株NFX104与Pseudomonas thivervalensis DSM 13194T具有高度同源性。功能注释分析显示，两株菌均具有广泛的代谢潜力。NFX21的基因组富含与碳水化合物代谢、核苷酸代谢和信号传导/细胞过程相关的基因，而NFX104则在环境信息处理、氨基酸代谢、能量代谢和异生物质（Xenobiotics）降解方面有更高的代表性。此外，基因组分析还揭示了两株菌都含有多重药物转运/外排系统基因、毒素基因以及多种分泌系统相关基因。
2.4. Serratia quinivorans NFX21抗真菌特征的基因组学解析
针对NFX21的基因组挖掘揭示了其潜在的多重抗真菌机制。antiSMASH分析预测了多个生物合成基因簇，包括一个高丝氨酸内酯（Homoserine Lactone）生物合成基因、两个非核糖体肽合成酶（Non-Ribosomal Peptide Synthetase, NRPS）簇、两个NRPS样簇、两个NRP-金属载体簇和一个NRPS非依赖型（NI）铁载体簇。其中，高丝氨酸内酯生物合成基因与参与群体感应（Quorum-sensing）的基因高度相似，可能调控着多种抗菌物质的产生。此外，NFX21基因组还包含几个几丁质酶（Chitinase）编码基因、丝氨酸蛋白酶（Serralysins）和其他胞外蛋白酶基因，这些酶可能通过降解真菌细胞壁发挥抗真菌作用。一个与Serratia marcescens的SwrW蛋白高度相似的基因，提示NFX21可能产生脂肽类生物表面活性剂serrawetin。
2.5. Pseudomonas thivervalensis NFX104抗真菌特征的基因组学解析
对NFX104的基因组分析则聚焦于已知的关键抗真菌代谢物。antiSMASH预测了九个BGCs，包括三个NRP-金属载体簇、一个NRPS簇、一个NRPS样簇、一个氰化氢（Hydrogen Cyanide, HCN）生物合成簇、一个III型聚酮合酶（Type III Polyketide Synthase, T3PKS）簇、一个膦酸酯（Phosphonate）生物合成簇和一个II类羊毛硫肽（Lanthipeptide-class-II）簇。其中，T3PKS基因编码的蛋白与Pseudomonas ogarae F113中参与2,4-二乙酰基间苯三酚（2,4-diacetylphloroglucinol, DAPG）生物合成的关键酶PhlD高度相似。进一步的详细分析证实，NFX104中的DAPG生物合成基因簇与具有抗真菌活性的P. thivervalensis PITR2和P. ogarae F113中的功能基因簇高度同源。同时，其氰化氢生物合成基因簇（hcnABC）也与P. thivervalensis PITR2的功能基因高度相似。DAPG和HCN都是假单胞菌属中已被广泛证实的重要抗真菌代谢物。
本研究通过整合功能验证与基因组学分析，系统评估了Serratia quinivorans NFX21和Pseudomonas thivervalensis NFX104作为新型灰霉病生防制剂的潜力。功能实验表明，两种菌株在体外能有效抑制B. cinerea的菌丝生长和孢子萌发，在植物体内（番茄离体叶片和盆栽实验）能显著降低灰霉病的发生率和严重程度，其防效与商用生物农药Serenade ASO®相当。基因组学分析为此提供了分子机制层面的解释：NFX21可能通过群体感应调控的机制，产生包括脂肽、铁载体和多种胞外裂解酶（如几丁质酶、丝氨酸蛋白酶）在内的多种抗真菌物质；而NFX104则拥有合成已知强效抗真菌代谢物DAPG和HCN的完整基因簇，同时还具有合成多种铁载体和其他潜在新型代谢物的能力。两株菌的基因组还编码了多种分泌系统和表面结构相关基因，这有助于它们在植物根际定殖并与病原菌竞争。
这项研究的重要意义在于，它不仅从功能上证实了两种新菌株对灰霉病的防治效果，更从基因组层面揭示了其多机制协同作用的潜力。这种“功能+基因组”的研究策略为理性筛选和开发新一代、作用机制多元化的生物防治剂提供了范例。将NFX21和NFX104开发为商业产品，有助于丰富当前以芽孢杆菌为主的生防菌资源库，为应对灰霉病这一全球性农业难题提供更可持续、更不易产生抗性的综合管理方案。未来的研究需要进一步验证这些预测的基因簇功能，并在温室和田间条件下评估菌株在实际农业生产中的稳定性和应用潜力。
