在全球气候变暖加剧的背景下，蒸发加剧与海水入侵正导致高盐度环境不断扩张。盐沼、内陆盐湖、盐田等生态系统是全球重要的碳和痕量金属储库。在这些环境中，铁的存在形式深刻影响着初级生产力和生物碳泵的强度。然而，高盐度与渗透压胁迫极大地限制了微生物多样性，使得嗜盐古菌成为主导。在厌氧的高盐沉积环境中，铁主要以不溶性的三价铁（Fe(III)）氧化物和氢氧化物形式存在，其极低的溶解度使得生物体难以直接利用。这引出了一个基础生物地球化学问题：在高盐系统中，维持微生物二价铁（Fe(II)）需求的生物可利用（溶解态）铁，其来源和产生机制是什么？在淡水及海洋细菌（如地杆菌和希瓦氏菌）中，通过胞外电子传递（Extracellular Electron Transfer, EET）还原不溶性矿物的过程已被深入研究。然而，对于嗜盐古菌如何在没有氧气的情况下获取能量，以及它们如何与Fe(III)氧化物等固态电子受体相互作用，人们却知之甚少。理解嗜盐古菌的Fe(III)还原和EET机制，对于揭示高盐环境下铁的生物地球化学循环、认识早期生命在厌氧环境中的生存策略，乃至开发高盐废水处理新技术，都具有重要意义。
为了填补这一知识空白，研究人员以模式极端嗜盐古菌Haloferax volcanii 为研究对象，探索其在严格厌氧和高盐（25%）条件下，能否利用水铁矿和导电电极作为胞外电子受体，还原Fe(III)并维持其生理代谢活性。这项研究发表在美国微生物学会旗下的经典期刊《Journal of Bacteriology》上。
为开展此项研究，作者采用了多学科交叉的技术方法。首先，他们建立了严格厌氧的批次培养体系，以水铁矿为电子受体，乳酸为电子供体，通过化学方法（菲啰啉法）监测Fe(II)的生成，并通过高效液相色谱（HPLC）分析乳酸、丙酮酸和核黄素的浓度变化，以关联代谢与还原过程。其次，利用电化学测量（包括恒电位测试和循环伏安法）验证了H. volcanii 的生物电化学活性及其生物膜表面的氧化还原特性。再者，通过蛋白质组学分析，比较了以氧气和Fe(III)氧化物为电子受体时H. volcanii 的蛋白表达差异，筛选出可能与EET通路相关的关键蛋白。此外，还通过更换电解液上清液和添加外源核黄素的实验，验证了核黄素作为电子穿梭体的间接EET机制。研究中的所有实验均设置了三重重复以确保可重复性。
Haloferax volcanii 还原Fe(III)氧化物
研究结果表明，H. volcanii 能够在高盐厌氧条件下有效还原水铁矿。在11天的培养期内，Fe(II)浓度持续增加，至第8天左右达到平台期，最终累积生成约1138.67 µM的Fe(II)，对应总铁的还原效率约为41%。扫描电镜（SEM）显示，反应后的矿物形态从无定形转变为具有层状结构的菱面体。在整个过程中，培养体系的pH保持稳定，排除了由溶液酸化驱动铁还原的可能性。同时，乳酸浓度显著下降，而丙酮酸作为检测到的唯一胞外代谢物有所积累。生物量（以蛋白含量计）没有显著增加，表明Fe(III)还原主要为H. volcanii 维持基本生理代谢活动的一种策略，而非用于大量生长。所有对照组（缺少乳酸、无菌培养基、死细胞悬液）均未观察到显著的Fe(III)还原，证实了该过程需要活细胞和可利用的电子供体。
H. volcanii 的胞外电子传递机制
基于电化学测试的氧化还原活性表征
当以电极代替Fe(III)氧化物作为电子受体时，H. volcanii 能够产生并维持电流，证明它是一种产电微生物。循环伏安测试显示，其生物膜在-0.41 V和-0.19 V处有两个明显的氧化峰，并在-0.48 V和-0.26 V处有对应的还原峰，表明生物膜表面存在具有氧化还原活性的物质，这些物质可能是其EET能力的主要介体。
通过上清液分析间接EET
基于基因组数据，H. volcanii 具有核黄素合成相关基因。通过电解液更换实验发现，H. volcanii 的上清液中存在能够介导电子转移的化合物。HPLC分析证实，在以水铁矿为电子受体的实验组和生物电化学系统的上清液中，均在约6.98分钟处出现了一个与核黄素标准品保留时间一致的色谱峰，而在以氧气为电子受体的有氧培养上清液中则未出现此峰。这证明当H. volcanii 利用不溶性物质作为胞外电子受体时，能够分泌核黄素作为电子穿梭体。添加0.2 µM外源核黄素可使Fe(III)还原效率相对提高约18%，平均日还原速率从152.83 µMFe(II) ·day-1 提升至181.19 µMFe(II) ·day-1 ，乳酸消耗也相应增加，进一步证实了核黄素介导的间接电子传递是H. volcanii 还原胞外Fe(III)氧化物的重要途径。
基于蛋白质组学结果的差异蛋白丰度分析
蛋白质组学分析揭示了当以Fe(III)氧化物代替氧气作为电子受体时，H. volcanii 体内一系列与能量代谢和电子传递相关的蛋白表达发生显著变化。在差异表达蛋白中，定位在细胞质膜外和与质膜相关的蛋白占比较高。研究发现：
1. 细胞色素 ：单血红素细胞色素c 亚基II（COX2，由基因Hlac_1165编码的蛋白B9LN21）在厌氧条件下的表达量比有氧条件下高6.92倍，它可能作为跨膜传递电子的候选关键蛋白。
2. 其他氧化还原活性蛋白 ：细胞色素P450（B9LUN1）和4Fe-4S铁氧还蛋白型结构域蛋白（B9LT38）的丰度分别增加了51.1%和67.2%，提示它们可能作为电子载体参与EET过程。
3. 膜结合醌细胞色素氧化酶 ：两个膜结合醌啉b 型细胞色素氧化酶（A0A841HB82和A0A841HBL7）的丰度分别增加了73.8%和120%，它们可能参与电子跨细胞质膜的转移。
4. 能量与离子转运蛋白 ：V型ATP合酶亚基和NhaP型Na+ /H+ 或K+ /H+ 逆向转运蛋白的丰度显著增加，反映了在Fe(III)还原过程中对质子动势和离子平衡的需求增强。此外，NADH:醌氧化还原酶（NDH）的丰度增加了60.9%，表明有更多来自NADH的还原力被导向下游的电子传递链，以支持EET。
综合以上结果，研究者提出了一个H. volcanii 胞外电子传递通路的假设模型。在该模型中，乳酸氧化产生的电子可能通过NADH脱氢酶传递给泛醌（UQ），形成泛醇（UQH2 ）。接着，电子可能经由醌醇-细胞色素c 还原酶、细胞色素c 以及膜结合醌啉b 型细胞色素氧化酶等组成的链式传递系统，最终输送至胞外，用于还原Fe(III)氧化物。同时，分泌的核黄素可以作为电子穿梭体，通过扩散或与细胞表面氧化还原蛋白（如细胞色素）结合的方式，介导间接的电子传递。然而，由于H. volcanii 具有由古菌醚脂质构成的单一细胞质膜和作为细胞壁的外部蛋白质S层，但缺少外膜和典型的周质空间，电子究竟如何穿越S层屏障到达胞外空间，其具体分子机制仍有待利用该菌株良好的遗传操作工具性进行深入解析。
这项研究首次证实了极端嗜盐古菌Haloferax volcanii 在高盐厌氧条件下具有异化还原Fe(III)氧化物的能力。其EET过程由直接和间接两种机制共同驱动：直接机制依赖于膜结合细胞色素（如细胞色素c 和醌啉b 型细胞色素氧化酶）的介导；间接机制则通过分泌核黄素作为电子穿梭体来实现。蛋白质组学数据进一步支持了与电子传递、能量转换和离子平衡相关的一系列蛋白在此过程中被特异性上调。该发现具有多重重要意义。在理论层面，它突破了以往认为嗜盐古菌缺乏有效EET策略的认知，揭示了古菌与细菌在利用类似氧化还原活性分子（如核黄素）和蛋白系统进行Fe(III)还原上可能存在的进化趋同性，为理解高盐胁迫下生物可利用铁的起源与维持机制提供了全新视角，也增进了对早期生命在厌氧高盐环境中生存策略的认识。在应用层面，H. volcanii 所展现的EET能力，特别是其核黄素介导的间接电子传递途径，为开发基于嗜盐微生物的电化学技术用于处理高盐废水中的污染物（如重金属、有机污染物）提供了极具潜力的候选菌种和理论依据。该研究将嗜盐古菌研究拓展至生物地球化学循环与生物能源/环境修复的交叉前沿，为后续利用遗传学手段深入剖析古菌EET的分子机理奠定了坚实基础。
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