在我们体内，免疫系统是忠诚的卫士，但有时它会“敌我不分”，对自身组织发起攻击，导致自身免疫性疾病。全球约有3-5%的人口受此困扰，生活质量大打折扣，也给医疗体系带来沉重负担。这些疾病背后，往往是错综复杂的细胞因子网络在“煽风点火”。其中，白细胞介素-6 (IL-6) 和白细胞介素-17A (IL-17A) 是两位臭名昭著的“炎症指挥官”。IL-6是个多面手，既能促进炎症，也能调节免疫，在类风湿性关节炎等疾病中，它驱动着B细胞、T细胞活化和关节破坏。IL-17A则主要由Th17细胞分泌，是招募炎症细胞、破坏组织的“急先锋”，在银屑病、强直性脊柱炎中扮演关键角色。更棘手的是，IL-17A和IL-6常常“狼狈为奸”，形成恶性循环：IL-17A能诱导产生更多IL-6，而IL-6又会促进产生更多分泌IL-17A的Th17细胞，让炎症愈演愈烈。
目前，临床上已有像托珠单抗 (抗IL-6R) 、司库奇尤单抗 (抗IL-17A) 这样的单克隆抗体药物，它们像“精确制导导弹”，能有效阻断单一通路，为许多患者带来了曙光。然而，面对IL-6和IL-17A等多条通路共同驱动的复杂炎症，单一的“导弹”有时显得力不从心，部分患者会出现疗效不佳或无效的情况。这就好比灭火时只堵住一个火源，而另一个火源仍在蔓延。那么，能否设计一种“双头导弹”，同时瞄准IL-6和IL-17A这两个关键靶点，实现“一石二鸟”的协同灭火效果呢？这成为了研究人员攻克复杂炎症疾病的新思路。基于此，一篇发表在期刊《Antibodies》上的研究，报道了开发一种能同时靶向人IL-6和IL-17A的双特异性抗体 (bispecific antibody, BsAb) 的探索之旅。
为开展此项研究，研究人员运用了几个关键的技术方法：首先，他们利用噬菌体展示 (phage display) 技术，从一个免疫了人IL-6和IL-17A的羊驼VHH (单域抗体) 文库中，筛选出能特异性结合这两个靶点的高亲和力VHH克隆。接着，通过生物层干涉技术 (Bio-Layer Interferometry, BLI) 精确测定抗体片段的结合动力学参数（如解离常数KD）。在功能验证方面，采用了HEK-Blue报告细胞系来评估抗体中和IL-6/IL-17A信号通路的能力（测定IC50）。此外，利用Uncle多功能蛋白质稳定性分析平台和LabChip毛细管电泳系统，对候选抗体的热稳定性、聚集倾向和纯度进行了全面的生物物理表征。研究中还使用了人成纤维样滑膜细胞 (HFLS) 和外周血单个核细胞 (PBMCs，来源于健康供者) 等更具疾病相关性的细胞模型，来评估抗体在更复杂生理环境中的抗炎效果。
3.1.1. VHH免疫文库的构建与筛选
研究人员通过三轮噬菌体展示淘选，从文库中初步筛选出针对IL-17A和IL-6的VHH克隆。经过序列比对去除重复克隆后，利用BLI技术对克隆的解离速率 (koff) 进行初筛，最终得到一批有结合活性的候选VHH。
3.1.2. VHHs的生产
筛选出的VHH在大肠杆菌中表达并纯化。通过SDS-PAGE、毛细管电泳和Uncle平台分析，评估了其纯度、热稳定性等生物物理性质。例如，抗IL-17A的领先克隆D3纯度达95.8%，熔解温度(Tm)为76°C；抗IL-6的领先克隆A5纯度为96.4%，Tm为65.6°C，表明它们具有较好的稳定性和开发潜力。
3.1.3. VHHs与人IL-17A和IL-6的结合
利用BLI对纯化后的VHH进行全面的动力学分析，测定了它们与靶标结合的亲和力 (KD)。结果显示，克隆D3 (抗IL-17A) 的KD为2.85 × 10-9M，克隆A5 (抗IL-6) 的KD为5.87 × 10-10M，均为纳摩尔级的高亲和力结合。
3.1.4. 使用HEK-Blue报告细胞评估VHHs的生物学活性
在细胞功能层面，使用对IL-6或IL-17A信号有反应的报告细胞系评估VHH的中和活性。数据显示，D3克隆中和IL-17A的IC50为0.67 nM，A5克隆中和IL-6的IC50为3.05 nM，证实了它们在细胞水平上能有效阻断细胞因子信号。
3.1.5. 结合亲和力与中和效力的相关性确定了领先的VHH候选分子
分析发现，VHH的体外中和效力 (IC50) 与其结合亲和力 (KD) 高度相关 (IL-17A: R2=0.8297; IL-6: R2=0.7714)，这为基于结合数据预测功能活性提供了依据，并最终确定D3和A5为构建双特异性抗体的最佳VHH单元。
3.2.1. 抗体CPBT0853的生产
将领先的VHH克隆D3和A5通过一个柔性连接肽((G4S)3)以头尾相连的方式，与人IgG1的Fc片段融合，构建了名为CPBT0853的单链双特异性抗体 (VHH-Fc-VHH格式)。该抗体在ExpiCHO-S细胞中瞬时表达，经亲和层析和分子筛纯化，获得高纯度 (约98%) 样品。生物物理表征显示其Tm为62.3°C，Tagg为64.8°C，多分散指数(PDI)低于0.1，表明分子均一、稳定。
3.2.2. CPBT0853对人、食蟹猴和小鼠IL-17A及IL-6的结合亲和力
BLI评估显示，CPBT0853对人及食蟹猴的IL-17A和IL-6均表现出极高的亲和力，KD值在低皮摩尔范围 (如人IL-17A: 1.25 pM；人IL-6: 2.85 pM)。这归因于Fc介导的二价结合产生的亲合力效应。它对IL-17A/F异源二聚体结合较弱 (KD=4.24 nM)，且不与小鼠同源细胞因子或人IL-17E/F结合，显示了其种属特异性和对IL-17A的高选择性。
3.2.3. CPBT0853抑制IL-17A/IL-17RA和IL-6/IL-6R相互作用的潜力
竞争结合实验证实，CPBT0853能以剂量依赖的方式，有效阻止IL-17A与其受体IL-17RA、以及IL-6与其受体IL-6R的结合，其阻断效力与已上市的单特异性参考抗体 (如Ixekizumab, Siltuximab) 相当。
3.3.1. 使用HEK-Blue报告细胞评估双特异性抗体的中和活性
报告细胞实验表明，CPBT0853能有效中和IL-17A和IL-6的信号，IC50分别为0.14 nM和0.20 nM，但对IL-17A/F异源二聚体的中和效力较低 (IC50=8.41 nM)。与单特异性VHH或参考抗体相比，CPBT0853实现了对两种细胞因子的同步抑制。
3.3.2. 双特异性抗体对IL-6诱导的STAT信号通路的抑制
在外周血单个核细胞 (PBMCs) 中，CPBT0853能有效抑制IL-6诱导的STAT1和STAT3磷酸化，IC50分别为0.032 nM和0.036 nM，证明其可在原代免疫细胞中阻断IL-6的下游信号传导。
3.3.3. 在人工纤维样滑膜细胞 (HFLS) 中评估双特异性抗体的生物学活性
在类风湿性关节炎相关细胞模型HFLS中，IL-17A刺激能强烈诱导IL-6和IL-8的产生。CPBT0853处理能最有效地抑制这两种炎症因子的分泌，其效果优于单独使用抗IL-17A或抗IL-6的单特异性对照抗体。这直接证明了同时靶向IL-17A和IL-6在抑制复杂炎症网络中的协同优势。
本研究成功开发并验证了一种基于VHH的、能同时靶向人IL-6和IL-17A的双特异性抗体。该研究从构建免疫文库开始，通过噬菌体展示筛选出高亲和力、高稳定性的VHH单元 (D3和A5)，并将其构建成具有良好生物物理性质的双特异性抗体CPBT0853。体外实验全面证实，CPBT0853能高效结合并中和IL-6和IL-17A，阻断它们与受体的相互作用及其下游信号通路 (包括STAT和NF-κB/AP-1通路)。更重要的是，在类风湿性关节炎相关的HFLS细胞模型中，该双特异性抗体展现出了比单特异性抗体更优异的抗炎效果，能更大幅度地抑制关键炎症因子IL-6和IL-8的产生。
这项研究的重要意义在于，它为解决复杂自身免疫和炎症性疾病中多重细胞因子通路紊乱的治疗难题提供了一种新的策略。传统的单靶点疗法有时无法完全控制疾病，而联合用药又可能增加副作用和治疗复杂性。本研究开发的双特异性抗体像一把“双刃剑”，有望通过一个分子同时干扰IL-6和IL-17A这两个在病理上相互放大、协同作恶的关键炎症通路，从而实现更高效、更协同的治疗效果，并可能降低用药剂量和副作用风险。这为开发治疗类风湿性关节炎、银屑病、强直性脊柱炎等疾病的新一代疗法奠定了坚实的基础，展示了多特异性抗体在征服复杂炎症疾病方面的巨大潜力。
