Berina Muhovic | Maria Puertas Bartolome | Lara Luana Teruel Enrico | Louise Dupont | Alain M. Jonas | Karine Glinel | Aranzazu del Campo | Christoph Wittmann
德国萨尔布吕肯萨尔兰大学系统生物技术研究所
摘要
活体治疗材料（LTMs）是一类新兴的生物材料，它们将活细胞整合到工程化的聚合物基质中，以实现动态和响应性的功能。在这项研究中，我们将一种稳健、无致病性且经过GRAS认证的微生物Corynebacterium glutamicum 改造为多功能生物工厂，用于LTMs的应用。利用合成生物学技术，我们设计并构建了能够感知、报告并产生极端溶质ectoine的C. glutamicum 菌株。Ectoine是一种临床可用的溶质，具有细胞保护和抗炎特性，广泛用于皮肤病制剂、鼻喷雾和眼科制剂中，用于治疗炎症和压力相关疾病。这些工程菌株被进一步封装在基于聚合物的活体材料中，包括膜在凝胶中的贴片和核壳水凝胶系统，以创建适用于皮肤和眼睛的治疗平台。我们开发了遗传生物传感器，可以检测二氨基丁酸（DABA），这是ectoine生物合成途径中的关键中间体，从而实现细胞功能的实时监测。这些生物传感器结合了荧光和酶报告系统，能够无创地可视化代谢活动。我们优化了封装策略，以确保高代谢活性、结构稳定性和生物安全性，同时实现ectoine的可控释放，为药物递送和保护性治疗提供潜在应用。这项工作突显了C. glutamicum 作为下一代LTMs的多功能平台的潜力，为精准医疗和环境生物传感应用提供了精确的监测和靶向治疗能力。
引言
活体治疗材料（LTMs）是生物技术、材料科学和医学交汇处的一个新兴领域[1]。LTMs是结合了活生物体（如细菌或工程细胞）与智能材料的系统[2][3][4]。这些系统具有动态性和响应性，为医学、环境修复等领域带来了新的应用可能性[5][6]。LTMs的一个重要方向是其在精准医疗中的应用[7]，其中治疗方案是根据个别患者或独特疾病环境进行定制的[8]。多功能细胞工厂在这一领域发挥着关键作用，使LTMs能够感知特定生物标志物、报告其环境状况，并以靶向和可控的方式生产治疗剂[9][10][11]。通过将这些能力整合到LTMs中，精准医疗可以实现更高的特异性和适应性[12][13]。合成生物学的最新进展显著展示了代谢工程微生物在诊断和治疗应用中的潜力[14][15][16][17]。
在这项工作中，我们以革兰氏阳性细菌Corynebacterium glutamicum 为例，探讨了LTMs的多功能细胞工程方面。C. glutamicum 因其在氨基酸生产和平台化学品生产中的工业应用而闻名[18][19][20][21]，最近被证明是整合到LTMs中的有希望的候选者[17]。这种微生物对压力具有显著的耐受性，使其成为需要稳定性和稳健性的应用的理想候选者[22]。值得注意的是，C. glutamicum 能够合成ectoine，这是一种在恶劣环境条件下具有保护作用的商业生产的极端溶质[23][24]。Ectoine可以稳定蛋白质和细胞结构，防止紫外线辐射，并保持水分[25]。由于这些保护特性，ectoine被广泛用作皮肤病制剂、鼻喷雾和眼科溶液中的生物活性成分，用于治疗炎症性皮肤和呼吸系统疾病以及眼部刺激[26][27]。
在这项工作中，我们利用合成生物学技术将C. glutamicum 设计为具有感知、报告和产生ectoine能力的多功能细胞工厂。这些工程菌株随后被整合到聚合物基质中，创建了先进的LTMs。设计包括适用于皮肤的活体软凝胶贴片原型和适用于眼睛的活体核壳水凝胶。这两种LTM系统都表现出可调的ectoine释放特性，并通过合成生物传感器-报告器控制电路实现了对关键细胞功能的精确、无创的荧光监测。这项研究代表了利用C. glutamicum 开发下一代LTMs的重大进展，为精准医疗、环境传感和自适应治疗系统打开了广泛的应用前景，同时在实际应用中提供了无与伦比的控制和功能。
C. glutamicum 的代谢工程：用于基于荧光的细胞和细胞功能可视化C. glutamicum ECT-2菌株最初被改造为在构成性Ptuf 启动子控制下表达来自Pseudomonas stutzeri 的优化密码子的ectoine生物合成簇(ectABCD ) [23]。这一改造使得在葡萄糖基矿物盐培养基中生长时能够持续合成和分泌ectoine（见补充图S1）。
我们进一步通过将基因整合到其基因组中，增强了ECT-2菌株的空间感知能力 结论
在这项研究中，我们成功地将C. glutamicum 改造为多功能生物工厂，用于活体治疗材料（LTMs），展示了其在精准医疗和环境生物传感中的应用潜力。通过合成生物学技术，我们开发了能够感知、报告并产生极端溶质ectoine的C. glutamicum 菌株。将这些工程菌株整合到不同应用目的的基于聚合物的材料中，是一个重要的步骤微生物和质粒
C. glutamicum ECT-2菌株源自之前的研究[23]。E. coli 菌株DH10B [43]和NM522 [44]分别用于质粒扩增和甲基化。为了在C. glutamicum 中实现外源基因表达，使用了赋予卡那霉素抗性的质粒pClik5a MCS [45]。使用整合质粒pClik int sacB [46]对C. glutamicum 进行了基因组修饰。所有菌株和质粒都储存在-80°C的30%甘油中。CRediT作者贡献声明
Berina Muhovic： 撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，可视化，验证，方法学，研究，形式分析，概念化。
Maria Puertas Bartolome： 撰写 – 审稿与编辑，验证，研究，形式分析。
Lara Luana Teruel Enrico： 撰写 – 审稿与编辑，验证，研究，形式分析。
Louise Dupont： 撰写 – 审稿与编辑，验证，方法学，研究，形式分析。
Alain M. Jonas： 撰写 – 审稿与编辑
利益冲突声明
目前有一项与本工作相关的专利申请已提交，BM、CW、MPB、LTTE和AdC被列为发明人。其余作者声明没有财务或非财务利益冲突。致谢
作者感谢莱布尼茨协会通过莱布尼茨科学园区活体治疗材料项目提供的资助。他们还要感谢it4ip S.A.（比利时）提供的光刻PC膜，以及鲁汶天主教大学提供的MICA平台在SEM分析方面的支持。CW还感谢德国研究基金会 通过项目INST 256/418-1提供的资助。此外，KG担任F.R.S.-FNRS的研究主任职位。打赏
