基于多策略抗原筛选发掘靶向委内瑞拉马脑炎病毒E2蛋白的新型“人源”VHHs及其病毒“海绵”功能探究

面对新发病毒（如委内瑞拉马脑炎病毒VEEV）缺乏有效疗法的问题，本研究通过噬菌体/酵母展示技术，利用重组E2蛋白、线性肽和灭活病毒三种抗原策略，筛选出靶向VEEV E2蛋白的四种新型“人源”VHHs。尽管不具备中和活性，但这些VHHs可结合并“海绵”式清除病毒颗粒，为应对蚊媒病毒威胁提供了创新的治疗性抗体开发策略和抗原筛选方法框架。

在气候变化与全球化进程交织的当下，蚊媒病毒的传播版图正悄然扩张，对人类健康构成日益严峻的挑战。在众多蚊媒病毒中，委内瑞拉马脑炎病毒（Venezuelan Equine Encephalitis Virus, VEEV）以其高传染性、潜在的空气传播能力以及对神经系统可造成严重甚至致命损伤的特性，被列为重要的生物防御威胁之一。然而，尽管其危害巨大，目前市场上既没有美国食品药品监督管理局（FDA）批准的疫苗，也缺乏有效的抗病毒疗法来预防或治疗VEEV感染。这一治疗空白，促使科学家们不断探索新的武器来对抗这类新发病毒。

抗体疗法，尤其是基于抗体的免疫疗法，在近年来的传染病防控中展现了巨大潜力。其中，源自骆驼等动物的重链抗体可变区（Variable heavy domain of heavy chain antibodies, V_HHs），也被称为纳米抗体（nanobodies），因其分子量小、稳定性高、易于工程化改造等优势，成为药物研发的新星。然而，针对VEEV等具有复杂包膜蛋白的病毒，如何高效地筛选出具有治疗潜力的V_HHs，特别是基于“人源”框架的V_HHs，仍是一个关键挑战。问题的核心之一在于抗原的选择——用什么样的“诱饵”去“钓”出最好的抗体？

近日，一项发表在《Frontiers in Immunology》杂志上的研究，为我们提供了一个多策略并行的精彩范例。研究团队的核心目标，正是为了开发针对VEEV的新型治疗性V_HHs，并系统性地评估不同抗原格式在抗体筛选中的效果。他们的思路非常清晰：既然单一的抗原形式可能无法完美呈现病毒蛋白的真实构象，那就“多管齐下”。为此，他们精心设计并平行使用了三种不同的“诱饵”：1）重组的VEEV E2糖蛋白（病毒的主要包膜蛋白之一）；2）基于分子动力学分析挑选出的E2蛋白线性肽段；3）经紫外线灭活的完整VEEV病毒颗粒。通过将这三种抗原分别应用于噬菌体展示和酵母展示技术进行筛选，研究人员希望能够找到那些能够紧密结合病毒关键部位，并有可能阻断其感染进程的“人源”V_HHs。

关键技术与方法概览

本研究综合运用了计算生物学、合成生物学与经典的抗体筛选技术。首先，通过分子动力学模拟和溶剂可及表面积（SASA）分析，从VEEV E2蛋白中筛选出表面暴露且可能形成聚集性表位的线性肽段（如P2肽）作为抗原。核心的抗体筛选基于一个半合成的人源化V_HH库，先后采用噬菌体展示进行两轮淘选，以及酵母展示进行多轮荧光激活细胞分选（FACS），以富集抗原特异性克隆。筛选后，通过牛津纳米孔技术（ONT）对富集群进行测序，鉴定优势克隆。获得的V_HH基因经合成后，以V_HH与人IgG1 Fc融合蛋白（V_HH-Fc）的形式表达纯化，用于后续功能验证。病毒相关的功能实验使用了VEEV疫苗株TC-83，关键验证手段包括酶联免疫吸附试验（ELISA）评估结合活性、空斑减少中和试验（PRNT）评估中和能力，以及基于蛋白G磁珠的病毒免疫沉淀（“海绵”）实验评估病毒清除效能。

研究结果：多策略筛选与功能验证

1. 抗原选择与筛选策略设计

研究人员首先评估了三种抗原格式的可行性。计算建模（）显示，从E2蛋白中选出的P2肽段在病毒颗粒表面暴露良好且成簇，被确定为重点筛选靶点。而重组E2蛋白由于需要在尿素中溶解复性，其构象可能无法完全代表天然状态。

2. 从半合成抗体库中筛选针对VEEV的重组V_HHs

使用三种抗原格式对噬菌体展示库进行两轮淘选后，多克隆噬菌体ELISA（）显示，针对P2肽和灭活病毒的筛选获得了强烈的特异性富集信号，而针对重组E2蛋白的筛选信号较弱。随后，研究人员将噬菌体筛选的输出库转移到酵母展示系统进行进一步富集。对于病毒筛选组，还引入了针对P2肽的交叉分选，以确保获得的抗体也能识别E2蛋白上的目标表位。

3. V_HHs的鉴定与结合特性分析

通过对最终酵母种群进行测序，研究人员挑选了19个独特的V_HH克隆，表达为V_HH-Fc融合蛋白并进行ELISA测试。结果表明（）：所有3个仅用P2肽筛选出的克隆（VHH-ss2-1, -2, -3）都能结合P2肽、重组E2蛋白和病毒颗粒；而用重组E2蛋白筛选出的克隆则无法结合肽段，且只有一个微弱结合E2蛋白；用灭活病毒筛选并经过肽段交叉富集的克隆中，有一个（VHH-ss3-6）能结合肽段和病毒，但仅微弱结合重组蛋白。这凸显了抗原格式对筛选结果的巨大影响。研究人员聚焦于上述四个结合病毒颗粒的V_HHs，它们具有不同的互补决定区3（CDR3）序列。滴定ELISA显示它们对P2肽和重组E2蛋白的表观亲和力（EC₅₀）在11-85 nM之间。

4. 病毒结合验证（中和与病毒“海绵”特性）

尽管这四个V_HHs能结合病毒颗粒，但在空斑减少中和试验中，它们均未显示出中和活性，这与阳性对照单克隆抗体VEEV-57形成对比。然而，在一个创新的“病毒海绵”功能实验中，情况发生了转变。当将这些V_HH-Fc预先结合在蛋白G磁珠上，再与病毒溶液共孵育时，它们能够有效地将病毒颗粒“吸附”并去除。沉淀病毒后的上清液感染性检测显示（2 PFU/mL VEEV virions for 1 h. Antibody-bound viruses were precipitated...">），VHH-ss2-3和VEEV-57的去除效果最强（分别减少98%和100%的噬斑），VHH-ss3-6、VHH-ss2-1和VHH-ss2-2也分别实现了80%、61%和46%的噬斑减少。这证明这些非中和性V_HHs具有通过物理捕获和清除来降低病毒载量的潜力。

结论与意义

本研究成功地利用多抗原格式筛选策略，从人源化V_HH库中发现了四种靶向VEEV E2蛋白新型表位的新型“人源”V_HHs。研究最关键的发现在于：首先，抗原格式是决定筛选成功与否的关键。线性肽（P2）和完整病毒颗粒作为抗原，比构象可能不天然的重组E2蛋白更能筛选出可结合天然病毒的有效V_HHs。这为未来针对其他复杂包膜病毒的抗体发现提供了重要的方法学参考。其次，非中和性抗体同样具有治疗应用潜力。尽管这些V_HHs不能阻止病毒进入细胞，但它们能够高效地结合病毒颗粒，并在“病毒海绵”实验中显著降低感染性病毒滴度。这揭示了一种不依赖于传统中和作用的新颖抗病毒机制，即通过捕获和隔离病毒来限制其传播和致病。

这些基于人源框架的V_HHs，与以往报道的源自动物的抗VEEV纳米抗体针对不同表位，为构建组合疗法或双特异性抗体提供了新的组件。其易于工程化的特性，使得它们可以被构建成多价形式或与功能性材料（如自组装生物聚合物）结合，以进一步增强其病毒捕获能力或赋予其他免疫功能。总之，该工作不仅为对抗VEEV这一重要病原体贡献了有潜力的候选治疗分子，更重要的是，它展示了一套可推广的、用于快速开发针对新发病毒的治疗性抗体（尤其是V_HHs）的抗原筛选与评估框架，对于未来应对未知的蚊媒病毒甚至其他包膜病毒威胁，具有重要的战略储备意义。