富马酸二甲酯通过Nrf2-Annexin A1轴调控线粒体融合进而抑制中性粒细胞胞外诱捕网形成及其在脓毒症免疫治疗中的潜力

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的过度释放是导致脓毒症等多器官功能障碍的关键因素。为寻找NET形成的药理学调控手段，研究人员探讨了TCA循环代谢物富马酸的酯化物——富马酸二甲酯（DMF）对LPS诱导的NETs的抑制作用。研究发现DMF通过激活Nrf2通路、增加抗炎因子Annexin A1分泌，并促进线粒体融合（表现为p-DRP1(Ser616)水平降低、MFN1/2及OPA1表达模式改变），从而显著抑制PAD4依赖的NET释放。该研究揭示了线粒体动力学在调控中性粒细胞炎症反应中的核心作用，为靶向线粒体的免疫代谢疗法提供了新思路。

中性粒细胞，作为我们身体免疫系统的“先头部队”，在抵抗病原体入侵时扮演着至关重要的角色。它们有一种独特的“撒网”本领，即释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。这张由DNA和多种抗菌蛋白构成的“天罗地网”，能有效捕获并杀灭细菌、真菌等病原体，是先天免疫防御中的一项精妙武器。然而，凡事过犹不及。在严重的感染（如脓毒症）或某些自身免疫性疾病中，NETs的释放会失控，从保护性的防御武器转变为破坏性的“友军炮火”。过度或清除不畅的NETs会损伤血管内皮细胞，促进血栓形成，并最终导致多器官功能障碍，严重威胁生命。因此，寻找能够“精准调控”而非“全面抑制”中性粒细胞功能，特别是能够安全、有效抑制病理性NET形成的药物或策略，是免疫学和炎症疾病治疗领域亟待解决的关键问题。

近年来，免疫代谢学——研究细胞代谢如何重编程并影响免疫细胞功能——的兴起，为这一难题提供了新视角。三羧酸循环（TCA cycle）中的中间代谢物，被发现不仅是能量货币的“生产原料”，更是调控免疫细胞炎症状态的关键信号分子。其中，富马酸（fumarate）及其酯化衍生物富马酸二甲酯（DMF）在巨噬细胞中已被证实具有通过激活转录因子Nrf2来发挥抗炎作用。DMF本身已是多发性硬化症的一线治疗药物。那么，这个“明星分子”能否“跨界”调控中性粒细胞的NET形成？其作用机制是否也涉及线粒体（毕竟富马酸就在线粒体中产生）？线粒体作为细胞的“能量工厂”和“信号枢纽”，其不断进行的融合与分裂动态，是否决定了中性粒细胞的命运是走向“撒网”还是“静默”？为了回答这些问题，一组研究人员在《Frontiers in Immunology》上发表了他们的研究成果，系统阐释了DMF抑制NETs的崭新机制。

为开展这项研究，作者们运用了多种关键的实验技术。他们首先从C57BL/6J野生型小鼠和PAD4基因敲除（Pad4^-/-）小鼠的骨髓中分离出高纯度的中性粒细胞作为研究模型。利用脂多糖（LPS）刺激模拟炎症状态诱导NET形成。通过免疫荧光染色共定位细胞外DNA（extDNA）、瓜氨酸化组蛋白H3（citH3）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE），对NETs进行可视化与定量分析，这是鉴定NETs的金标准。研究还采用了流式细胞术结合MitoTracker™ Green FM检测线粒体质量，使用TMRE探针评估线粒体膜电位（Δψm）。通过免疫荧光检测Nrf2、磷酸化DRP1（p-DRP1^Ser616）、线粒体融合蛋白（MFN1， MFN2， OPA1）及PANoptosis关键蛋白ZBP1的定位与表达。使用ELISA法检测细胞上清中Annexin A1（ANXA1）的分泌水平。通过Annexin V/PI、Caspase 3/7活性、FDA/PI及Live-or-Dye™等多种染色与检测方法，综合评估细胞凋亡、坏死、代谢活性及PANoptosis等不同死亡模式。此外，还使用了透射电子显微镜（TEM）观察了线粒体超微结构和细胞死亡形态。在机制验证中，广泛使用了Nrf2抑制剂ML385、线粒体融合促进剂Mdivi-1、裂解诱导剂CCCP、ANXA1受体Fpr2拮抗剂WRW4等药理学工具进行干预。

Fumarate， a TCA intermediate metabolite， inhibits NETs。研究人员发现，LPS能有效诱导小鼠中性粒细胞形成典型的NETs（extDNA、citH3、NE共定位），而DMF预处理能强效抑制这一过程。有趣的是，在缺乏NET形成关键酶PAD4的基因敲除小鼠中性粒细胞中，DMF依然展现出相同的抑制效果，这排除了DMF通过非经典途径释放DNA的可能，明确了其抑制的是PAD4依赖的经典NET途径。

Fumarate causes fusion of mitochondria。机制探索首先聚焦于线粒体。结果显示，LPS刺激会降低线粒体质量，而DMF并未改变此趋势。但深入分析线粒体动力学发现，DMF处理几乎完全消除了动力相关蛋白1在丝氨酸616位点的磷酸化（p-DRP1^Ser616），这是线粒体分裂的关键标志。同时，线粒体融合蛋白MFN1、MFN2和OPA1的染色呈现出更连续、互连的模式，类似于线粒体融合促进剂Mdivi-1的效果。相反，线粒体裂解剂CCCP则导致MFN1呈点状碎片化分布。功能上，Mdivi-1能像DMF一样完全抑制NET形成，而CCCP处理则出现了一个矛盾现象：extDNA仍大量释放，但citH3和NE这两种NET特征蛋白的释放却被抑制了。这提示CCCP导致的extDNA释放可能并非典型的NETosis。

DMF does not cause neutrophil death。研究人员排除了DMF通过直接杀伤中性粒细胞来抑制NET的可能性。细胞活性检测、凋亡指标（Caspase 3/7）分析均显示DMF不增加细胞死亡。相反，DMF降低了PANoptosis（一种整合了凋亡、焦亡和坏死的炎症性程序性死亡）的关键启动蛋白ZBP1的水平，并恢复了LPS降低的线粒体膜电位，发挥了细胞保护作用。抑制线粒体复合物I的呼吸功能并不影响NET形成，说明DMF的作用特异于线粒体动力学而非全局性能量抑制。

Nrf2 and Annexin A1 are involved in DMF-dependent NETs inhibition。进一步机制研究表明，Nrf2通路至关重要。虽然DMF未进一步增加LPS诱导的Nrf2表达，但使用Nrf2抑制剂ML385在DMF处理后进行阻断，可完全逆转DMF对NET的抑制。同时，DMF能增加细胞上清中抗炎蛋白Annexin A1（ANXA1）的分泌。阻断ANXA1的受体Fpr2，同样能恢复NET形成。这表明DMF通过激活Nrf2，并可能通过ANXA1-Fpr2轴，协同抑制NETs。有趣的是，抑制Nrf2并未显著影响ANXA1的分泌，提示ANXA1的释放可能存在不依赖Nrf2的平行通路，但Nrf2的激活对于实现最终的NET抑制是必需的。

CCCP-dependent extDNA release is not a NETosis 与 CCCP-dependent mitochondrial fragmentation/fission drives neutrophil death。回到CCCP的谜题。研究发现，即使在Pad4^-/-细胞中，CCCP仍能导致extDNA释放，这强烈提示此DNA非NET来源。随后的细胞死亡分析揭示，CCCP处理导致大量细胞死亡，膜完整性丧失（Live-or-Dye™阳性增加），早期/晚期凋亡细胞（Annexin V/PI阳性）增多，细胞代谢活性（FDA染色）显著下降。透射电镜观察显示，CCCP处理的细胞出现严重的线粒体碎片化、空泡化和自噬结构，是典型的病理性死亡形态，而非形成NET的细胞所表现的胞内囊泡等结构。

CCCP is not involved in NET formation nor impacts the process 与 PANoptosis is involved in CCCP-related extDNA release。综合证据表明，CCCP诱导的强烈线粒体分裂并不导致NET形成，反而将细胞推向死亡。进一步研究证实，这种死亡具有PANoptosis的特征：ZBP1表达显著升高；涉及Caspase 3/7激活的凋亡通路；且使用焦亡抑制剂（Disulfiram）或坏死性凋亡抑制剂（Necrostatin-1）都能部分减少CCCP引起的extDNA释放。这说明在极端线粒体压力下，中性粒细胞是通过启动PANoptosis这种高度炎症性的程序性死亡，导致细胞崩解并释放DNA，这与受调控的、以捕获病原体为目的的NETosis有本质区别。

研究结论与意义。本研究系统阐明了富马酸二甲酯（DMF）抑制中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成的多重机制。核心结论在于，DMF作为一个线粒体相关的免疫代谢调节剂，通过协同激活Nrf2信号通路和ANXA1-Fpr2抗炎轴，并关键性地促进线粒体融合、抑制病理性分裂，从而有效遏制了PAD4依赖的NET释放。研究首次在中性粒细胞中将DMF的抗炎作用与线粒体动力学直接联系起来，发现线粒体融合（如Mdivi-1诱导）的状态有利于抑制NETs，而剧烈的线粒体分裂（如CCCP诱导）则会引发中性粒细胞发生PANoptosis，导致炎症性死亡和DNA释放，但这并非NETosis。这项工作具有多重重要意义。首先，它从免疫代谢和细胞器动力学的全新角度，揭示了调控NET形成的关键内在开关，即线粒体的融合/分裂平衡，为理解中性粒细胞的命运决定提供了新范式。其次，研究将DMF——一个已用于治疗多发性硬化症的临床药物——的作用机制拓展至脓毒症等以NETs过度释放为特征的急性炎症领域，为其“老药新用”治疗感染性休克、急性肺损伤等疾病提供了直接的理论依据和实验支持。最后，研究强调了Nrf2作为连接代谢、氧化应激、线粒体稳态和炎症消退的核心枢纽地位，提示靶向Nrf2-线粒体轴可能是未来开发精准调控中性粒细胞功能、抑制免疫病理损伤而不损害宿主防御功能的新型治疗策略的突破口。