CELENA®X活细胞成像：一键搞定转染效率精准评估

前言

转染是一种将核酸引入细胞的常用技术，对研究基因及其产物的功能和调控具有重要意义。建立一种可重复高通量的方法来准确评估转染效率是至关重要的。在本研究中，使用CELENA®X高内涵成像系统研究了质粒浓度对转染效率的影响。

细胞准备

用LUNA-IITM自动细胞计数仪计数HeLa细胞，在96孔板上以1×104个HeLa细胞/孔的密度接种，并培养过夜。为了评估转染效率，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，11668)并根据厂家的protocol，用不同浓度的表达GFP的 pCG-HttQ103质粒(对照，0.05 g，0.1 g 和0.2 g)转染HeLa细胞。转染后24小时，细胞在100µL 4% PFA中室温固定15分 钟。用Hoechst33342(Life Technologies，H3570)复染细胞核以计数细胞总数。

成像和分析 

使用CELENA®X高内涵成像系统观察GFP表达和细胞核形态。使用基于图像的自动聚焦和10X LWD 高NA值物镜、结合Hoechst33342(DAPI光立方: Ex395/25，Em460/50)和 GFP (EGFP光立方: Ex470/30，Em530/50)所需的滤光片进行图像获取。 

为了对转染效率进行定量分析，利用集成的CELENA®X Cell Analyzer分析软件对图像进行自动化批量处理和分析。使用软件的IdentifyPrimaryObjects 模块基于Hoechst 33342核染色对单个细胞进行分割，而使用 IdentifySecondaryObjects 模块对表达GFP的细胞进行鉴定。在Hoechst定义的边界内每个细胞的GFP荧光强度可通过MeasureObjectIntensity模块进行定量。使用FilterObjects模块设置荧光强度阈值以消除假阳性、鉴定转染细胞并确定转染效率，阈值设置为阴性对照组细胞中GFP通道图像的中值荧光强度的最大值。

表1. CELENA®X Cell Analyzer软件评估转染效率的流程。

为了使数据可视化，使用GraytoColor模块将颜色应用于每个通道的灰度图像，并且使用 OverlayOutlines模块将图像与所鉴定的细胞和转染区域的轮廓重叠以确认分割精度(图1)。

图1. 转染24小时后HeLa细胞中绿色荧光蛋白表达的图像分析。较高的质粒浓度与GFP阳性细胞数量增加相关(绿色)。蓝线表示对照Hoechst染色的细胞核(蓝色)和红线表示GFP阳性细胞轮廓。

图2. 转染效率的量化。将GFP阳性细胞的数目与Hoechst染色的细胞数目进行比较。表达绿色荧光蛋白的pCG-HttQ103质粒浓度的增加提高了转染效率。

结论

在本研究中，使用CELENA®X 高内涵成像系统分析了质粒浓度对转染效率的影响。自动捕获多孔板中粘附的HeLa细胞的图像并批量处理以识别分析对象，测量荧光强度，应用荧光强度阈值和标记图像以帮助可视化数据。如图1和2所示，转染效率随着质粒浓度的增加而增加。

使用 CELENA®X 进行荧光细胞成像并自动定量分析每张图像的多个细胞特征，为研究人员监测基于转染的细胞分析提供了一种简单的方法，可以很容易地重复使用同一个分析流水线来验证或比较分析后续实验的结果。

参考文献

[1] Dalby B, Cates S, Harris, A, Ohki EC, Tilkins ML, Price PJ, Ciccarone VC. 2004. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods, 33: 95-103. 

[2] Hsu CJ, Jain HV, Williams A, Wang J, Lute SC, Beaucage SL, Brorson KA. 2018. Trans-acting oligodeoxythymidine phosphorothioate triester reagents for transient transfection optimized and facilitated by a high-throughput microbioreactor system. Biotechnology and Applied Biochemistry, 65: 467-75. 

[3] Osorio JS, Bionaz M. 2017. Plasmid transfection in bovine cells: Optimization using a realtime monitoring of green fluorescent protein and effect on gene reporter assay. Gene, 626: 200-208. Tamm C, Kadekar S, Pijuan-Galitó S, Annerén C. 2016. Fast and efficient transfection of mouse embryonic stem cells using non-viral reagents. Stem Cell Reviews and Reports, 12: 584-91.

产品介绍

CELENA®X拥有基于图像和激光的自动对焦模块，以及全电动的XYZ移动载物台，大大简化了多孔板扫描以及切片扫描的时间。无论简单的固定细胞分析还是复杂的、延时活细胞分析，强大而灵活的软件都可以让你建立高级图像分析程序，用来定量分析固定细胞和活细胞的特征。CELENA®X是药物发现与生命科学研究的有利工具。

自动化成像系统

1、四种成像模式：四通道荧光、明场、彩色明场、相差成像

2、全自动的孔板扫描：全自动孔板扫描，电动XYZ载物台，自动光源、荧光通道和物镜的切换

3、基于激光的快速自动对焦：减少光毒性和光漂白，加快拍摄速度

4、强大易用的采集和分析软件：简单直观的成像protocol设置，与分析流程无缝衔接

5、自定义的高内涵分析：基于表型批量分析多通道成像图片

6、支持活细胞成像：载物台孵育系统适适用于各种生理或非生理条件下的成像实验

7、多种配件可选

• 多种适配器：

显微玻片、腔室玻片、各种规格培养瓶、培养皿、6-1536微孔板。

• 多种物镜：

1.25-100x放大倍数的空气镜或油镜可选。

• 可置换荧光光立方：

12种不同波段的光立方，覆盖市面上常见的荧光染料的波长，支持特殊波段光立方定制，用户可在实验室自主完成滤镜更换。

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