产油酵母Candida maltosa的高脂质生产力菌株的分离及其在麦糟半纤维素水解物中的应用潜力

为降低可再生油化学品生产成本并推进生物精炼，本研究从土壤中分离得到两株可高效利用木糖并耐受水解抑制剂的产油酵母Candida maltosa UFV-1和UFV-2。研究人员优化了其在麦糟半纤维素水解物中的生长和产脂条件，经脱毒后生物量和脂质产量均显著提升，其中UFV-1在生物反应器中实现了0.29 g/L·h的高脂质产率，展现了利用低成本木质纤维素原料生产微生物油脂的良好前景。

随着化石燃料价格波动、能源安全问题凸显以及人们对二氧化碳排放环境影响的日益担忧，寻找能够替代石油衍生品的替代性油脂化学生产工艺变得至关重要。微生物脂质，也称为单细胞油脂，因其在功能性食品、植物基食品、动物饲料、化妆品、药品以及脂肪酸衍生生物燃料和生物塑料生产等多个工业领域的广泛应用而备受关注。然而，利用葡萄糖、木糖等纯化底物工业化生产单细胞油脂的成本高昂，限制了生物工艺的可行性。低成本木质纤维素副产品，如啤酒酿造业的主要固体副产物麦糟，富含半纤维素，是生物精炼中酵母培养的潜在替代碳源。全球啤酒市场庞大且持续增长，进一步增加了麦糟的可获得性，强化了其作为生物技术应用低成本原料的潜力。

尽管碳水化合物含量高，但木质纤维素生物质由于植物细胞壁结构复杂且刚性强，具有高度的抗降解性，阻碍了微生物获取可发酵糖。稀酸水解是常用的预处理策略之一，但它会同时产生糠醛、羟甲基糠醛和乙酸、甲酸等有机酸抑制剂，这些物质会干扰酶活性和微生物代谢，降低生物质转化为生物基产品的效率。其中，乙酸是半纤维素水解物中最普遍的抑制剂之一。在低pH下，其未解离形式可自由穿过细胞膜，导致细胞内酸化和代谢稳态破坏，抑制生长。因此，分离能够耐受这些抑制化合物并利用可再生碳源生产脂质的稳健酵母菌株，对于提高微生物油脂生产的经济可行性至关重要。

在此背景下，研究发表于《World Journal of Microbiology and Biotechnology》。本研究从巴西Viçosa联邦大学教学、研究和推广单位的土壤样本中，分离并筛选能够利用木糖、耐受乙酸等水解抑制剂的产油酵母。通过中心复合旋转设计和响应面法优化了菌株在麦糟半纤维素水解物中的培养条件，评估了初始pH和氮源比例的影响。研究比较了脱毒与非脱毒水解物对菌株生长和产脂的影响，并在台式生物反应器中验证了最优菌株的产脂性能，测定了其脂肪酸组成。

为开展此项研究，作者主要运用了以下几项关键技术方法：1) 从特定土壤环境中进行酵母菌的分离与形态学、分子生物学鉴定（PCR指纹图谱、D1/D2区测序）；2) 采用多步筛选策略，评估分离株在木糖、乙酸等抑制物存在下的生长能力及产油表型；3) 利用中心复合旋转设计结合响应面法，优化菌株在麦糟半纤维素水解物中的培养条件（pH、氮源比例）；4) 在摇瓶和台式生物反应器水平评估菌株在脱毒与非脱毒水解物中的生长、底物消耗、脂质产量及生产力；5) 采用SPV法进行脂质定量，并通过气相色谱分析脂肪酸组成。

研究结果

Isolation and PCR-fingerprinting：从土壤样品中共分离到61株酵母，经过形态学表征和基于M13与(GAC)₅引物的PCR指纹图谱分析，最终确定了22株遗传上不同的酵母分离株。

Screening of yeast isolates capable of growing on sugars constituents of lignocellulosic biomasses and tolerating acetic acid：对31株分离株进行初筛，其中16株能够在以木糖为唯一碳源的培养基中生长（OD₆₀₀≥ 0.5）。进一步评估这16株菌在含2 g/L乙酸的木糖培养基中的耐受性，其中7株在72小时后OD₆₀₀≥ 0.5，被选中进行下一步脂质生产筛选。

Screening of selected yeast isolates regarding lipid production：在C:N为100:1的SS2培养基中，5株分离株（CPII-3, CPII-4, CPII-6, CPIII-5, CSII-5）的脂质含量达到或超过20%（w/w），符合产油微生物标准。在添加1.0 g/L乙酸的相同培养基中，CPII-4和CPIII-5受乙酸影响较小，仍保持较高的生物量和脂质滴度。

Taxonomic identification of isolates CPII-4 and CPIII-5：通过D1/D2区测序和系统发育分析，将分离株CPII-4和CPIII-5鉴定为Candida maltosa，分别命名为UFV-1和UFV-2。

Effect of different C:N ratios on the oleaginous phenotype of C. maltosa UFV-1 and UFV-2：评估不同C:N比对两株菌产油表型的影响。对于UFV-1，脂质含量在不同C:N比下无显著差异，但在125:1时生物量和脂质滴度最高。对于UFV-2，仅在C:N为100:1时脂质含量显著最高。

Effects of furfural, HMF and formic acid on C. maltosa UFV-1 and UFV-2 growth：评估菌株对其他水解抑制物的耐受性。两株菌在高达2.0 g/L糠醛和4.0 g/L HMF的培养基中生长良好。甲酸抑制作用更强，从0.5 g/L起即抑制生长，但在复杂培养基（YP）中耐受性略优于基本培养基（YNB）。

Definition of cultivation conditions for C. maltosa UFV-1 and UFV-2 in malt bagasse hemicellulosic hydrolysate：初步评估显示菌株在pH 2.0和3.0时不生长，在pH 6.0和7.0时生长良好。通过中心复合旋转设计优化，确定了UFV-1在pH 6.0、氮源为1.0 g/L蛋白胨、UFV-2在pH 6.5、氮源为0.58:0.42 g/L蛋白胨/酵母提取物时，脂质产量表现最佳。

验证与生物反应器培养：在优化的条件下，使用脱毒水解物显著提升了菌株性能。与未脱毒条件相比，UFV-1的生物量从9.12 g/L增至17.0 g/L，脂质滴度从0.84 g/L增至3.14 g/L；UFV-2的生物量从10.5 g/L增至12.9 g/L，脂质滴度从0.91 g/L增至1.58 g/L。脂肪酸谱分析显示，脱毒后饱和脂肪酸（如16:0、18:0、10:0）比例增加。在台式生物反应器中培养UFV-1（脱毒水解物），生物量达到79.55 g/L，脂质产率达到0.29 g/L·h。

结论与讨论：本研究成功分离出两株具有应用潜力的产油酵母Candida maltosa UFV-1和UFV-2。它们能够有效利用木糖，并耐受包括乙酸、糠醛、HMF和甲酸在内的多种木质纤维素水解抑制物。通过优化培养条件，特别是使用脱毒的麦糟半纤维素水解物，显著提高了菌株的生物量和脂质产量。在生物反应器中，C. maltosa UFV-1展现了高的脂质产率。该研究强调了从特定环境（如农业土壤）中生物勘探功能微生物的价值，并为利用啤酒工业副产物麦糟等低成本木质纤维素原料进行微生物油脂生产，进而推动基于生物精炼的可持续油化学品开发提供了有前景的菌株资源和工艺基础。C. maltosa 在复杂抑制物存在下仍能保持产油表型，其脂质积累调控机制可能与其他经典产油酵母（如Yarrowia lipolytica）不同，值得进一步研究。总体而言，这项工作朝着实现基于木质纤维素生物质的、经济可行的微生物油脂生物精炼迈出了重要一步。